[發明專利]一種脯氨酸?4?羥化酶及其重組表達宿主菌的應用

在審

• 申請號: 201710546679.8
• 申請日: 2017-07-06
• 公開（公告）號: CN107189990A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 石貴陽;朱惠霖;吳志勇;李由然
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N1/21;C12P13/24;C12R1/125
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙)32228
• 代理人: 聶啟新

1.一種脯氨酸-4-羥化酶，其特征在于編碼該所述酶的基因序列如SEQ ID No.1所示；所述酶的蛋白質序列如SEQ ID No.2所示。

2.一種含有權利要求1所述脯氨酸-4-羥化酶的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于所述菌株的重組方法包括如下步驟：

(1)制備來源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp.RH1)，經過芽孢桿菌密碼子優化的脯氨酸-4-羥化酶基因p4h；

(2)將步驟(1)制得的脯氨酸-4-羥化酶基因p4h連接到含有木糖啟動子的誘導型表達載體pHY-Bs.xyl上，制得含有脯氨酸-4-羥化酶的重組質粒pHY-Bs.xyl-P4H；

(3)將步驟(2)所得的重組質粒轉入枯草芽孢桿菌WB600中，得到重組菌WB600/pHY-Bs.xyl-P4H，即所述重組枯草芽孢桿菌。

3.一種權利要求2所述重組枯草芽孢桿菌的應用，其特征在于該重組枯草芽孢桿菌可用于合成反式-4-羥脯氨酸。

4.一種含有權利要求1所述脯氨酸-4-羥化酶的經遺傳改造的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于所述菌株的構建方法如下：

(1)敲除原始菌株WB600的谷氨酰胺合成酶基因glnA；且過表達谷氨酸激酶基因proB，構建了重組菌WB601；

(2)制備來源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp.RH1)，經過枯草芽孢桿菌密碼子優化的脯氨酸-4-羥化酶基因p4h；

(3)將步驟(2)制得的脯氨酸-4-羥化酶基因p4h連接到含有木糖啟動子的誘導型表達載體pHY-Bs.xyl上，制得含有脯氨酸-4-羥化酶的重組質粒pHY-Bs.xyl-P4H；

(4)將步驟(3)制得的重組質粒pHY-Bs.xyl-P4H轉入WB601中，得到重組菌WB601/pHY-Bs.xyl-P4H，即所述經遺傳改造的重組枯草芽孢桿菌。

5.一種權利要求4所述經遺傳改造的重組枯草芽孢桿菌的應用，其特征在于該重組枯草芽孢桿菌可用于合成反式-4-羥脯氨酸。