[發明專利]用于擴增樣品中多個目標DNA序列的引物組及其應用

有效

• 申請號: 201710546580.8
• 申請日: 2016-05-06
• 公開（公告）號: CN107446995B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 屈武斌;蔡萬世;易建明;杭興宜
• 申請（專利權）人: 艾吉泰康（嘉興）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 北京匯知杰知識產權代理有限公司 11587
• 代理人: 蔡倫

本發明提供了用于擴增樣品中多個目標DNA序列的引物組以及使用所述引物組擴增樣品中多個目標DNA序列的方法，所述引物組包括針對每個目標DNA序列的多對上下游特異性引物：每對所述上下游特異性引物包括針對目標序列的特異性序列，所述特異性序列之間滿足如下條件：(1)與目標序列之外的序列不發生擴增、(2)之間不形成二聚體、(3)不形成發卡結構；在所述特異性序列的5’端連接有與基因組不同源的通用序列；在所述特異性序列的3’端有增加空間位阻的修飾，所述修飾不阻斷其與所述特異性序列完全匹配的模板的結合與延伸，但基本阻斷其與不完全匹配的模板的結合與延伸。

本申請是申請日為2016年5月6日，申請號為201610293653.2，發明名稱 為“用于擴增樣品中多個目標DNA序列的引物組及其應用”的發明專利申請的 分案申請。

技術領域

本發明涉及核酸序列的捕獲、富集與分析。更具體來說，本發明涉及基于多 重PCR的目標序列富集方法。

背景技術

全基因組測序可以獲得全基因組水平范圍的突變、插入、缺失以及結構變異。 然而，由于基因組容量巨大，以30×進行測序就會產生接近100G的數據量。而 腫瘤等相關的低突變頻率測序則需要至少1000×的覆蓋度，如果進行全基因組 測序，則會產生3000G的數據量。這樣規模的數據量除了會對數據的分析工作 造成極大的困難，還會顯著增加測序的成本，進而制約測序的應用。為了解決這 個難題，目標區域捕獲技術應運而生。

目標區域捕獲技術是指通過特定的技術手段定向捕獲目標區域的核酸序列， 然后進行建庫測序，以達到在對目標區域進行深度測序的目的的同時使得測序成 本大大降低。PCR是一種常見的用于富集目標區域的技術，更為常見的是利用 多重PCR技術一次性的捕獲多個目標區域。多重PCR適用于熱點區域或者長度 較小的目標區域的捕獲。制約多重PCR技術應用的兩個重要因素是非特異擴增 和二聚體的產生。

因此，本領域中需要能有效降低非特異擴增和二聚體產生的多重PCR技術 出現。

發明內容

本發明提供了基于多重PCR擴增的目標序列富集方法，所述方法包括：兼 容性多重PCR引物的篩選；進行第一輪特異性多重PCR擴增；進行第二輪通用 引物擴增富集；回收產物并上機測序。

因此，在第一方面，本發明提供了用于擴增樣品中多個目標DNA序列的引 物組，所述引物組包括針對每個目標DNA序列的多對上下游特異性引物，其中：

a)每對所述上下游特異性引物包括針對目標序列的特異性序列，所有特異 性序列之間滿足如下條件：(1)每個特異性序列與目標序列之外的序列不發生擴 增，(2)特異性序列之間不形成二聚體，(3)特異性序列不形成發卡結構；

b)在所述特異性序列的5’端連接有與基因組不同源的通用序列；

c)在所述特異性序列的3’端的堿基處有增加空間位阻的修飾，所述修飾不 阻斷其與所述特異性序列完全匹配的模板的結合與延伸，但基本阻斷其與不完全 匹配的模板的結合與延伸。

在一個具體的實施方案中，所述特異性序列之間滿足如下條件：(1)所述特 異性序列與目標區域的Tm–與非目標區域的Tm≥5℃，優選≥10℃；(2)所述 特異性序列與目標區域的Tm–與其他特異性序列形成二聚體的Tm≥5℃，優選 ≥10℃；(3)所述特異性序列與目標區域的Tm–形成發卡結構的Tm≥5℃，優 選≥10℃，優選Tm的值基于SantaLucia 2007熱力學參數表的最鄰近法計算。