[發(fā)明專利]用于擴增樣品中多個目標DNA序列的引物組及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710546580.8
• 申請日: 2016-05-06
• 公開（公告）號: CN107446995B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 屈武斌;蔡萬世;易建明;杭興宜
• 申請（專利權(quán)）人: 艾吉泰康（嘉興）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 北京匯知杰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11587
• 代理人: 蔡倫

1.用于擴增樣品中多個目標DNA序列的引物組，所述引物組包括針對每個目標DNA序列的多對上下游特異性引物，其中：

a)每對所述上下游特異性引物包括針對目標序列的特異性序列，所有特異性序列之間滿足如下條件：(1)每個所述特異性序列與目標序列之外的序列不發(fā)生擴增；(2)所述特異性序列之間不形成二聚體；(3)所述特異性序列不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；

b)在所述特異性序列的5’端連接有與基因組不同源的通用序列；

c)在所述特異性序列的3’端的堿基處有選自如下的修飾：脫氧次黃嘌呤、脫氧尿嘧啶、5-Methyl dC、2'-O-Me-dC、磷酸基團、AminolinkerC7、BHQ1、BHQ2、Dabcyl、JOE、ROX、FAM、TAMRA、烷基基團、氟代基團、氨基基團和Thiol-C3S-S，所述修飾不阻斷其與所述特異性序列完全匹配的模板的結(jié)合與延伸，但基本阻斷其與不完全匹配的模板的結(jié)合與延伸，其中，所述3’端的堿基處的修飾包括3’端-1、-2、-3位堿基、核糖或磷酸二酯鍵上的修飾。

2.權(quán)利要求1的引物組，所述特異性序列之間滿足如下條件：(1)所述特異性序列與目標區(qū)域的Tm–與非目標區(qū)域的Tm≥5℃；(2)所述特異性序列與目標區(qū)域的Tm–與其他特異性序列形成二聚體的Tm≥5℃；(3)所述特異性序列與目標區(qū)域的Tm–形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的Tm≥5℃。

3.權(quán)利要求2的引物組，所述特異性序列與目標區(qū)域的Tm–與非目標區(qū)域的Tm≥10℃。

4.權(quán)利要求2的引物組，所述特異性序列與目標區(qū)域的Tm–與其他特異性序列形成二聚體的Tm≥10℃。

5.權(quán)利要求2的引物組，所述特異性序列與目標區(qū)域的Tm–形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的Tm≥10℃。

6.權(quán)利要求2-5任一項的引物組，所述Tm值基于SantaLucia 2007熱力學參數(shù)表的最鄰近法計算。

7.權(quán)利要求1-5任一項的引物組，所述特異性序列的3’端的5個堿基的GC含量大于50％，在所述特異性序列的3’端-4位堿基處有增加空間位阻的修飾，其中，所述特異性序列的3’端-4位堿基處的增加空間位阻的修飾為氟代修飾、甲基修飾、脫氧尿嘧啶、硫代修飾、脫氧次黃嘌呤或氨基修飾。

8.權(quán)利要求1-5任一項的引物組，所述特異性引物序列有一致的熱力學參數(shù)。

9.權(quán)利要求8的引物組，所述特異性引物序列Tm標準差≤5℃。

10.權(quán)利要求9的引物組，所述特異性引物序列Tm標準差≤2℃。

11.權(quán)利要求10的引物組，所述特異性引物序列Tm標準差≤1℃。

12.一種擴增樣品中多個目標DNA序列的方法，包括

a)提供包含目標DNA序列和非目標序列的樣本、權(quán)利要求1-11任一項的引物組和與所述特異性引物5’端通用序列互補的通用引物對；

b)以所述引物組中的特異性引物進行多重PCR反應(yīng)，擴增所述樣本中的多個目標DNA序列，所述多重PCR反應(yīng)的退火溫度按照從高到低的階梯進行；

c)以所述通用引物對再次擴增步驟b)中的擴增產(chǎn)物，進一步富集所述擴增產(chǎn)物。

13.權(quán)利要求12的方法，其中步驟b)中在一個退火過程中使用等差的多個溫度進行退火。

14.權(quán)利要求12的方法，所述方法還包括步驟b’)：回收步驟b)中富集的擴增產(chǎn)物。

15.權(quán)利要求14的方法，所述回收是通過采用磁珠對第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行片段篩選和純化，去除目標區(qū)域外的大片段、基因組DNA、引物二聚體、引物和其他反應(yīng)成分，得到目標區(qū)域序列的PCR產(chǎn)物。

16.權(quán)利要求12-15任一項的方法，所述方法還包括步驟d)對步驟c)得到擴增產(chǎn)物進行測序。