[發(fā)明專利]一種基于吸光度的高準確度核酸濃度測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710546327.2
• 申請日: 2017-07-06
• 公開（公告）號: CN107328724B
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設計）人: 武利慶;高運華;鄭康樂;羅一;楊彬;金有訓;米薇;盛靈慧;王志棟
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 北京雙收知識產(chǎn)權代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新

1.一種基于吸光度的高準確度核酸濃度測定方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)準備核酸標準物質和核酸樣品，以及對應的空白緩沖溶液；

(2)用空白緩沖溶液將核酸標準物質進行梯度稀釋，以空白緩沖液作為空白，采用紫外-可見分光光度計或微量紫外-可見分光光度計分別測定稀釋后的各個濃度水平標準物質以及待測樣品的吸光度，使得樣品的吸光度位于各個濃度水平標準物質吸光度的中值附近；如果樣品濃度較高，可用空白緩沖液進行稀釋，通過重量法稱量的方式確定準確的稀釋比；將測定的各個水平核酸標準物質溶液的吸光度與其對應濃度進行線性擬合，根據(jù)標準曲線和樣品的吸光度，計算出樣品的初測濃度c₀；

(3)根據(jù)初測濃度，用核酸標準物質配制K₁c₀和K₂c₀的一對標準， 采用括號法對核酸樣品濃度進一步測定，其中0.90≦K₁≦1.00，1.00≦K₂≦1.10；根據(jù)配制過程，計算出這一對標準品各自的標準不確定度u₁和u₂，并進一步計算出測定結果的合成標準不確定度u_c；

(4)求解非線性規(guī)劃min u_c，使其滿足0.90≦K₁≦1.00，1.00≦K₂≦1.10的條件，得到K₁和K₂的具體值；

(5)根據(jù)計算出的K₁和K₂的值，配制出高標和低標，并采用括號法對樣品進行測定，得到樣品的準確結果c。

2.根據(jù)權利要求1所述的基于吸光度的高準確度核酸濃度測定方法，其特征在于：所述步驟(1)中：當核酸標準物質與待測樣品溶液基體相同時，測定時采用與之對應的緩沖溶液作為空白；當核酸標準物質與待測樣品溶液基體不同時，測定時分別采用標準物質的空白溶液和樣品的空白溶液進行吸光度0點校正。

3.根據(jù)權利要求2所述的基于吸光度的高準確度核酸濃度測定方法，其特征在于：所述步驟(2)具體要求包括：采用最小二乘法或加權最小二乘法進行線性擬合得到標準曲線，且線性相關系數(shù)r≧0.999；繪制標準曲線的數(shù)據(jù)點個數(shù)不少于5個并且在最低和最高濃度之間均勻分布；待測樣品吸光度位于標準曲線的中段附近。

4.根據(jù)權利要求3所述的基于吸光度的高準確度核酸濃度測定方法，其特征在于：所述步驟(3)采用括號法測定并計算樣品濃度及標準合成不確定度計算公式如下：

公式1為

公式2為

5.根據(jù)權利要求4所述的基于吸光度的高準確度核酸濃度測定方法，其特征在于：所述步驟(4)具體包括：求解非線性規(guī)劃：min u_c＝f(K₁,K₂)，0.90≦K₁≦1.00，1.00≦K₂≦1.10，得到K₁和K₂的具體值。