[發明專利]一種基于吸光度的高準確度核酸濃度測定方法

有效

• 申請號: 201710546327.2
• 申請日: 2017-07-06
• 公開（公告）號: CN107328724B
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發明（設計）人: 武利慶;高運華;鄭康樂;羅一;楊彬;金有訓;米薇;盛靈慧;王志棟
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新

本發明公開了一種基于吸光度的高準確度核酸測定方法，包括如下步驟：(1)準備核酸標準物質和核酸樣品以及對應的空白緩沖溶液。(2)用空白緩沖溶液將核酸標準物質進行梯度稀釋，分別測定稀釋后的各個濃度水平標準物質以及待測樣品的吸光度。計算出樣品的初測濃度c₀。(3)根據初測濃度用核酸標準物質配制K₁c₀和K₂c₀的一對標準采用括號法對核酸樣品濃度進一步測定。根據配制過程，計算出這一對標準品各自的標準不確定度u₁和u₂，并進一步計算出測定結果的合成標準不確定度u_c。(4)通過求解非線性規劃使不確定度最小從而得到K₁和K₂的具體值。(5)根據計算出的K₁和K₂的值，配制出高標和低標，并采用括號法對樣品進行測定，得到樣品的準確結果c。

技術領域

本發明涉及分光光度法檢測領域，特別是涉及一種基于吸光度的高準確度核酸濃度測定方法。

背景技術

計量是實現單位統一、量值準確可靠的活動，研究建立高準確度的測量方法是計量學研究的重要內容之一。含量(濃度)描述了單位質量或體積中被測對象的數量，是化學與生物計量中的基本量值。紫外分光光度法是測量核酸含量(濃度)的常用方法，它基于核酸在紫外區的光吸收根據朗伯比爾定律對核酸含量(濃度)進行測定，朗伯比爾定律的數學表達式如下：

A＝εlc (1)

其中：

A——吸光度；

ε——吸光系數；

l——光程；

c——濃度。

在測定時，通常選取260nm核酸最大吸收波長處進行測定，并根據1個吸光度單位(1OD)約等于50μg/mL的換算系數，對核酸進行定量。這種測定方式雖然簡單，但是定量的誤差較大。

為了實現核酸含量的準確測定，可進一步采用核酸標準物質對未知樣品的核酸濃度進行測定，首先將標準物質用合適的緩沖溶液稀釋成一定的梯度比例，然后分別測定各個不同梯度水平下核酸標準物質的吸光度，據此繪制標準曲線。接著測定未知樣品的吸光度，并根據標準曲線計算出待測樣品的濃度。這種測定方式采用了標準物質進行量值的傳遞，大大提高了核酸含量測定的準確度，但是該方法在設計時沒有將不確定度的影響考慮進去，同時采用標準曲線的計算方式導致將不同濃度梯度水平的線性誤差引入到了測量結果中，因此要實現基于吸光度的核酸濃度的準確測定，必須解決上述兩個問題。

發明內容

本發明針對在方法設計中未考慮不確定影響及標準曲線法定量引入了過大的線性擬合的不確定度的問題，建立了一種基于吸光度測定的高準確度核酸定量方法，包括如下步驟：

(1)準備核酸標準物質和核酸樣品，以及對應的空白緩沖溶液；

(2)用空白緩沖溶液將核酸標準物質進行梯度稀釋，以空白緩沖液作為空白，采用紫外-可見分光光度計或微量紫外-可見分光光度計分別測定稀釋后的各個濃度水平標準物質以及待測樣品的吸光度，使得樣品的吸光度位于各個濃度水平標準物質吸光度的中值附近；如果樣品濃度較高，可用空白緩沖液進行稀釋，通過重量法稱量的方式確定準確的稀釋比；將測定的各個水平核酸標準物質溶液的吸光度與其對應濃度進行線性擬合，根據標準曲線和樣品的吸光度，計算出樣品的初測濃度c₀；