[發明專利]甘蔗桿狀病毒Dot-ELISA檢測方法及其試劑盒與應用

有效

• 申請號: 201710544828.7
• 申請日: 2017-07-05
• 公開（公告）號: CN107290533B
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 溫榮輝;陳保善;王鳳林;黃增飛;李書巧
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

本發明公開了一種甘蔗桿狀病毒Dot?ELISA檢測試劑盒，主要包括兔抗的甘蔗桿狀病毒外殼蛋白制備的多克隆抗體和辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗兔lgG標準液。據此，發明人還建立了相應的Dot?ELISA檢測方法，并將之用于甘蔗中甘蔗桿狀病毒檢測。與現有技術相比，本發明具有靈敏度高、特異性好、成本低、高通量、檢測快速等優點。

技術領域

本發明屬于甘蔗桿狀病毒檢測領域，尤其涉及一種甘蔗桿狀病毒Dot-ELISA檢測方法及其試劑盒與應用。

背景技術

甘蔗是世界上最重要的糖料作物，也是最具潛力的可再生能源作物。甘蔗生長過程中會受到病毒的危害，且經過長期無性繁殖，多種病毒會積累在不同甘蔗品種及種質材料中，導致其種性退化，產量和品質下降，給甘蔗產業造成巨大的損失。

甘蔗桿狀病毒病是由甘蔗桿狀病毒(Sugarcane bacilliform virus，SCBV)感染引起的一種病害，該病害于1985年首次在古巴的甘蔗上發現，迄今為止世界上主要的甘蔗種植區均報道了該病的發生。近年來，我國大陸地區陸續在廣東、廣西和云南的甘蔗上檢測到SCBV核酸同源序列。SCBV屬于花椰菜病毒科(Caulimoviridae)桿狀DNA病毒屬(Badnavirus)，目前共分為8個種和13個種群。該病毒粒體為桿狀，其基因組為雙鏈環狀松弛DNA。SCBV主要通過甘蔗種莖進行遠距離傳播，近距離可通過蔗莖紅粉蚧進行傳播，但難以通過機械傳播。甘蔗受到SCBV侵染后可產生多種癥狀，一些品種出現葉片雀斑和斑駁，發病嚴重的植株葉片出現不同程度的褪綠條紋和矮縮，但癥狀表現不穩定，有時會出現隱癥侵染。

目前檢測病毒常用的方法大致分為分子檢測技術和血清學檢測技術兩類。分子檢測技術是一種基于核酸水平的檢測，具有準確高效、靈敏快速的特點，但操作比較復雜，成本很高。常見的SCBV檢測方法為PCR檢測技術，首先需要對甘蔗提取總DNA，再進行PCR擴增，最后進行電泳分析，甚至還要進行基因組序列測定。PCR技術操作過程繁瑣、耗時長，并且該技術完全依賴于PCR儀器和商業化的試劑，所以實驗成本較高，不利于田間病毒病的大規模檢測。此外，PCR技術假陽性較高，整個過程需要專業人員操作，難以普及推廣。以單克隆抗體為核心建立的血清學檢測技術是較為簡便的檢測方法，它具有操作方便、靈敏度高等優點。但常用的血清學方法----ELISA需要在96孔酶聯反應板進行，實驗步驟多，各步驟反應時間長，數據要借助酶標儀讀取；其材料成本高和對儀器高度依賴的特點不利于大規模樣品的檢測。

斑點酶聯免疫吸附試驗(Dot-ELISA)是以硝酸纖維素膜(nitro cellulosemembrane，NCM)為載體而發展起來的一種酶聯免疫吸附方法，具有試劑用量少、操作簡便、反應快速、不需要特殊儀器設備輔助、結果直觀等特點。此外，Dot-ELISA檢測還具有靈敏度高、特異性強、成本低等優勢，適于大批量樣品檢測。然而，至今未見將Dot-ELISA檢測技術應用于甘蔗病毒檢測，因缺乏標準化的試劑和材料，難以在非實驗室環境下進行，不能進行田間檢測，更難以實現大規模樣品的快速檢測。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種靈敏度高、特異性好、成本低、高通量、檢測快速的甘蔗桿狀病毒Dot-ELISA檢測方法及其試劑盒與應用。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：甘蔗桿狀病毒Dot-ELISA檢測試劑盒，主要包括兔抗的甘蔗桿狀病毒外殼蛋白制備的多克隆抗體和辣根過氧化酶標記的羊抗兔lgG標準液。

制備按以下操作進行：從NCBI網站獲得SCBV的CP基因序列，預測CP蛋白的氨基酸序列，選取暴露于天然蛋白外表的多肽為抗原，合成該多肽，將此多肽與弗氏佐劑混合免疫兔子，采集兔子血液，經親和層析純化獲得多克隆抗體。

多肽具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。