[發明專利]甘蔗桿狀病毒Dot-ELISA檢測方法及其試劑盒與應用

有效

• 申請號: 201710544828.7
• 申請日: 2017-07-05
• 公開（公告）號: CN107290533B
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 溫榮輝;陳保善;王鳳林;黃增飛;李書巧
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

1.一種甘蔗桿狀病毒Dot-ELISA檢測試劑盒，其特征在于包括兔抗的甘蔗桿狀病毒外殼蛋白制備的多克隆抗體和辣根過氧化酶標記的羊抗兔lgG標準液；所述制備按以下操作進行：從NCBI網站獲得SCBV的CP基因序列，預測CP蛋白的氨基酸序列，選取暴露于天然蛋白外表的多肽為抗原，合成該多肽，將此多肽與弗氏佐劑混合免疫兔子，采集兔子血液，經親和層析純化獲得多克隆抗體；所述多肽為序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。

2.使用權利要求1所述試劑盒的甘蔗桿狀病毒Dot-ELISA檢測方法，其特征在于以所述兔抗的甘蔗桿狀病毒外殼蛋白制備的多克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標記的羊抗兔lgG標準液作為二抗對甘蔗中的甘蔗桿狀病毒進行Dot-ELISA檢測。

3.根據權利要求2所述的甘蔗桿狀病毒Dot-ELISA檢測方法，其特征在于按以下步驟進行操作：

A.PVDF膜的活化：將畫方格的PVDF膜用甲醇活化2min；

B.樣品處理：取0.2-0.5g待測甘蔗樣品將其制成勻漿，離心或靜置沉淀，取上清液用包被緩沖液稀釋2-8倍備用；

C.樣品包被：取20μL所測樣品或SCBV抗原標準液滴在經甲醇活化了的PVDF膜點樣孔中，在室溫條件下包被1-2h；

D.洗滌：將已包被好的PVDF膜放置在培養皿中，加入PBST緩沖液漂洗3次，每次5min；

E.封閉：將PVDF膜取出浸入封閉液中，室溫條件下孵育1h，期間震蕩3-4次，取出后用PBST緩沖液漂洗3次，每次5min；

F.抗體孵育：將PVDF膜浸入1：40000稀釋的所述兔抗的甘蔗桿狀病毒外殼蛋白制備的多克隆抗體標準液中，室溫條件下孵育45min，漂洗3次；再將PVDF膜浸入1：8000稀釋的辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG標準液中，室溫條件下孵育30min，用PBST緩沖液漂洗3次，每次5min；

G.底物顯色及終止反應：將PVDF膜浸入沉淀型TMB底物顯色液中，室溫條件下避光顯色10min，取出在蒸餾水中漂洗2次以終止反應，把PVDF膜置于濾紙上干燥，記錄試驗結果并避光保存；

H.結果判定：觀察PVDF膜上的顏色，并與陽性和陰性結果比較，比陰性對照顏色深即為陽性；反之則為陰性。

4.權利要求1所述甘蔗桿狀病毒Dot-ELISA檢測試劑盒用于甘蔗中甘蔗桿狀病毒的Dot-ELISA檢測的用途。