[發明專利]一種強化表達Streptomyces sp.FA1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌

有效

• 申請號: 201710544473.1
• 申請日: 2017-07-06
• 公開（公告）號: CN107142225B
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發明（設計）人: 吳敬;吳丹;潘陽
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種強化表達Streptomyces sp.FA1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，屬于基因工程領域。本發明擴增獲得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的目的基因，連接到表達載體pGAPZαA?PARS上，導入畢氏酵母KM71/pPIC9K?XynA中獲得畢氏酵母重組菌。本發明還公開了一種重組畢氏酵母工程菌的生產方法，包括如下步驟：(1)利用全基因合成技術合成自主復制序列PARS；(2)構建表達載體pGAPZαA?PARS；(3)構建重組表達載體pGAPZαA?PARS?XynA；(4)畢氏酵母宿主的轉化及陽性轉化子篩選；(5)搖瓶誘導培養；(6)重組畢氏酵母工程菌發酵罐水平誘導生產木聚糖酶。

技術領域

本發明涉及一種強化表達Streptomyces sp.FA1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，屬于基因工程領域。

背景技術

木聚糖酶屬于糖苷水解酶[EC 3.2.1.x]，根據作用位點的不同，這類酶可分為兩種：一類是作用于木聚糖的主鏈骨架，主要有內切β-1,4-D-木聚糖酶和β-木糖苷酶，前者作用于木聚糖中間β-1,4-D-糖苷鍵，后者則是作用于低聚木糖的末端分解成木糖單糖，在這兩種酶的共同參與下，實現木聚糖的降解。第二類是作用于作用于支鏈取代基的酶，包括α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶[EC 3.2.1.55]、α-D-葡萄糖醛酸酶[EC 3.2.1.139]、乙酰木聚糖酯酶[EC 3.2.1.72]、p-香豆酸酯酶[EC 3.1.1]等。

木聚糖酶分布廣泛，主要來自自然界中一些真菌、細菌、一些無脊椎的動物體內以及植物組織等，既可以通過動植物體內提取，也可以通過微生物發酵獲木聚糖酶。人們研究比較多的是微生物產木聚糖酶，已經報道的產木聚糖酶菌株有各種霉菌和鏈霉菌以及芽孢桿菌等。木聚糖酶種類繁多組成各異，性質上也有所不同。

木聚糖酶能應用在多個領域中。在食品領域可以用于面制品烘焙，能夠改善面制品的品質；另外木聚糖可用于制備低聚木糖。在飼料工業木聚糖酶和其他半纖維素酶一起添加在飼料中利于增加飼料營養分解。在制漿和造紙工業領域，木聚糖酶可作為預漂白劑處理紙漿，從而降低紙漿漂白過程中化學試劑使用量，減少對環境的污染。在紡織工業麻類植物的纖維素含量豐富，是紡織行業中纖維原材料，但是麻類植物中含有半纖維素、木質素、果膠等雜質不利于紡織，木聚糖酶可以進行脫膠以去除這些膠質，減少化學品對環境的污染。迄今為止，國內外已報道了400多種木聚糖酶基因，大多數木聚糖酶在野生菌中表達量僅在10-20IU·mL-1。為了進一步推動木聚糖酶在工業生產中的應用，利用分子生物學方法將木聚糖酶基因進行異源表達以提高木聚糖酶的表達水平，是目前普遍采用的木聚糖酶制備方式。

畢氏酵母表達系統是近年發展起來的應用廣泛的真核表達系統。畢氏酵母菌屬于單細胞微生物，具有生長力旺盛、營養條件簡單、發酵技術成熟、pH適應范圍較寬、不產有毒物質等優點，至今已有數百種的外源蛋白利用該表達系統表達成功。用于外源基因表達的啟動子主要有乙醇氧化酶(AOX)啟動子和3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(GAP)。AOX是一種強啟動子，以甲醇為誘導劑能嚴格控制外源蛋白的誘導表達。GAP啟動子則屬于組成型啟動子，在菌體生長過程中都能啟動表達。外源基因的表達方式有兩種，分別是整合到基因組中表達和構建游離的重組質粒進行表達。整合型表達中通過將外源基因整合到微生物基因組中從而使菌株具有遺傳穩定的特點。基于質粒高拷貝數通過構建游離表達質粒進行表達可獲得多拷貝外源基因表達菌株，從而顯著提高表達量。目前在畢氏酵母表達系統中均是構建整合型重組菌株進行外源基因重組表達，尚未見到采用游離型表達質粒來進行表達。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種穩定的、可以大量分泌木聚糖酶的游離表達型畢氏酵母重組菌及其構建方法，工業應用前景廣闊。

本發明的第一個目的是提供一種表達木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，所述畢氏酵母重組菌是將木聚糖酶基因連接到含有自主復制序列的游離表達載體上，然后轉化至已整合表達木聚糖酶基因的畢氏酵母中，得到畢氏酵母重組菌。