[發(fā)明專利]一種強(qiáng)化表達(dá)Streptomyces sp.FA1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710544473.1
• 申請(qǐng)日: 2017-07-06
• 公開（公告）號(hào): CN107142225B
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳敬;吳丹;潘陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種表達(dá)木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，其特征在于，所述畢氏酵母重組菌是將木聚糖酶基因連接到含有自主復(fù)制序列的游離表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)化至已整合表達(dá)木聚糖酶基因的畢氏酵母中，得到畢氏酵母重組菌，所述木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述自主復(fù)制序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述游離表達(dá)載體為通過將核苷酸序列如SEQ ID NO:2的PARS復(fù)制子連接到pGAPZαA質(zhì)粒上得到pGAPZαA-PARS游離表達(dá)載體。

2.一種權(quán)利要求1所述畢氏酵母重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)獲得氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的木聚糖酶基因；

(2)獲得序列如SEQ ID NO:2所示的自主復(fù)制子PARS基因；

(3)將步驟(2)所得PARS基因與質(zhì)粒pGAPZαA相連，得到表達(dá)載體pGAPZαA-PARS；

(4)將步驟(1)中的木聚糖酶基因與步驟(3)中的表達(dá)載體pGAPZαA-PARS相連，得到重組載體pGAPZαA-PARS-XynA；

(5)將重組載體pGAPZαA-PARS-XynA轉(zhuǎn)化到已整合表達(dá)木聚糖酶基因的畢氏酵母中，得到所述畢氏酵母重組菌。

3.權(quán)利要求1所述的畢氏酵母重組菌生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)以權(quán)利要求1所述畢氏酵母重組菌為生產(chǎn)菌株，活化后，30℃、200rpm條件下培養(yǎng)24h，得一級(jí)種子發(fā)酵液；

(2)以2.5％接種量接種一級(jí)種子發(fā)酵液至種子培養(yǎng)基中，30℃、200rpm條件下培養(yǎng)24h，得二級(jí)種子發(fā)酵液；

(3)以10％的接種量將二級(jí)種子發(fā)酵液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃、200rpm進(jìn)行發(fā)酵；

(4)待DO值迅速上升時(shí)，進(jìn)行補(bǔ)料，OD600＝100時(shí)停止補(bǔ)料，饑餓至第二次出現(xiàn)DO值迅速上升時(shí)繼續(xù)補(bǔ)料。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為BSM培養(yǎng)基；其中BSM培養(yǎng)基包括如下成分：85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄ 0.93g/L，K₂SO₄18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM₁ 4.35mL/L，上述成分均溶于水中形成所述BSM培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述方法中補(bǔ)料配方為100％甲醇、1.25％PTM₁；甲醇和PTM₁溶于水中形成所述補(bǔ)料。

6.權(quán)利要求1所述畢氏酵母重組菌在飼料、食品、紡織或化工領(lǐng)域的應(yīng)用。