[發明專利]一種評價兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710543974.8
• 申請日: 2017-07-05
• 公開（公告）號: CN107290541A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 王芳;宋艷華;范志宇;胡波;魏后軍;仇汝龍;薛家賓;陳萌萌
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙)32238
• 代理人: 袁靜

技術領域

本發明涉及獸用診斷制品，具體涉及一種評價兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA試劑盒及其應用。

背景技術

兔出血癥病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus，RHDV)是兔病毒性出血癥(Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD)又稱兔瘟的病原，是一種嚴重威脅家兔產業發展的高傳播性、高致死性病毒，病程一般為48-72小時。該病于1984年首先在中國報道，隨后迅速在全球大部分地區流行，造成數以億計的家兔和野兔死亡，給全球的兔產業和生態造成巨大損失和破壞。1989年,世界動物衛生組織(OIE)將該病正式列為B類傳染病，我國將其列為二類傳染病。

目前，對兔病毒性出血癥滅活疫苗效力評價方法為經典的血凝抑制試驗(Hemagglutination inhibition test，HI)，所用到的血為人的“O”型紅細胞，由于“O”型紅細胞難以獲得，使得試驗難以開展，HI難以應用于大量樣本的檢測，此外，通過HI試驗篩選和測定抗體，血清樣品需要進行白陶土等的處理，對血凝價的判定，4單位HA的標定，試驗用PBS液pH控制等，整個試驗過程對操作者的要求相對較高，試驗的周期較長，結果的人為因素影響較大、靈敏度較低。

發明內容

本發的目的是提供一種評價兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA試劑盒，該試劑盒原料易得、操作簡單、耗時短、靈敏度較高、結果準確、直觀容易判斷。

本發明還提供采用上述試劑盒評價兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA方法。

本發明的目的采用如下技術方案實現：

一種評價兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA試劑盒，包括：檢測板、VP60VLPs溶液、抗兔出血癥病毒單克隆抗體1B8和HRP標記的羊抗鼠IgG抗體；

所述檢測板是采用H(type-2)-PAA-biotin包被的96孔高結合力親和素化酶標反應板；

所述VP60VLPs是兔出血癥病毒VP60蛋白形成的病毒樣顆粒；

在本發明中，所述VP60VLPs溶液采用如下方法制備：將重組桿狀病毒rAcV-Bac-VP60采用Sf9細胞進行培養，然后采用蔗糖密度梯度離心法純化獲得。

優選的技術方案中，H(type-2)-PAA-biotin的包被濃度為1.5-3.5μg/mL；所述VP60VLPs溶液的濃度為1-3μg/mL

優選的技術方案中，所述96孔高結合力親和素化酶標反應板在包被后采用4-6％脫脂乳溶液封閉后得到所述檢測板。

在本發明中，所述試劑盒還包括樣品稀釋液、洗滌液、終止液、標準陽性血清、標準陰性血清和顯色液；

所述樣品稀釋液為PBS緩沖液；

所述洗滌液是含有0.05％吐溫-20的PBS緩沖液；

所述終止液為2M的硫酸水溶液；

標準陽性血清：采用兔病毒性出血癥疫苗免疫SPF兔，取HI效價＞2⁶的兔血清，作為標準陽性血清；

標準陰性血清：SPF兔血清。

優選的技術方案中，所述VP60VLPs溶液濃度為1-3μg/mL。

本發明還提供采用所述試劑盒評價兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA方法，包括如下步驟：

1)將100μL待檢血清、標準陽性血清、標準陰性血清分別與100μL濃度為2μg/mL的VP60VLPs溶液混合，37℃孵育1.5h，得到待檢血清、標準陽性血清、標準陰性血清的預處理液；

2)在檢測板的待檢血清孔、陽性對照孔、陰性對照孔中分別加入100μL待檢血清、標準陽性血清、標準陰性血清的預處理液，37℃孵育1.5h，采用洗滌液洗滌；

3)將單克隆抗體1B8，加入酶標板中，100μL/孔，37℃孵育1h，采用洗滌液洗滌；

4)加HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，100μL/孔，37℃孵育1h，采用洗滌液洗滌；

5)加顯色液，100μL/孔，避光反應10min進行顯色；

6)每孔加入50μL終止液；

7)采用酶標儀檢測各孔在450nm波長處的吸光值OD_450nm，按照如下公式計算阻斷率PI：

阻斷率PI＝(陰性對照孔OD_450nm-待檢血清孔OD_450nm)/陰性對照孔OD_450nm×100％；