[發(fā)明專利]一種評(píng)價(jià)兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710543974.8
• 申請(qǐng)日: 2017-07-05
• 公開（公告）號(hào): CN107290541A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王芳;宋艷華;范志宇;胡波;魏后軍;仇汝龍;薛家賓;陳萌萌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 南京匯盛專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32238
• 代理人: 袁靜

1.一種評(píng)價(jià)兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA試劑盒，包括：檢測板、VP60 VLPs溶液、抗兔出血癥病毒單克隆抗體1B8和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體；

所述檢測板是采用H（type-2）-PAA-biotin包被的96孔高結(jié)合力親和素化酶標(biāo)反應(yīng)板；

所述VP60 VLPs是兔出血癥病毒VP60蛋白形成的病毒樣顆粒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述評(píng)價(jià)兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA試劑盒，其特征在于所述VP60 VLPs溶液采用如下方法制備：將重組桿狀病毒rAcV-Bac-VP60采用Sf9細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后采用蔗糖密度梯度離心法純化獲得。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述評(píng)價(jià)兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA試劑盒，其特征在于H（type-2）-PAA-biotin的包被濃度為1.5-3.5μg/mL；所述VP60 VLPs溶液的濃度為1-3μg/mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述評(píng)價(jià)兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA試劑盒，其特征在于所述96孔高結(jié)合力親和素化酶標(biāo)反應(yīng)板在包被后采用4-6%脫脂乳溶液封閉后得到所述檢測板。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述評(píng)價(jià)兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括樣品稀釋液、洗滌液、終止液、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和顯色液；

所述樣品稀釋液為PBS緩沖液；

所述洗滌液是含有0.05%吐溫-20的PBS緩沖液；

所述終止液為2M的硫酸水溶液；

標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：采用兔病毒性出血癥疫苗免疫SPF兔，取HI效價(jià)＞2⁶的兔血清，作為標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；

標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：SPF兔血清。

6.采用權(quán)利要求1所述試劑盒評(píng)價(jià)兔病毒性出血癥疫苗免疫效力的阻斷ELISA方法，包括如下步驟：

1）將100μL待檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清分別與100μL濃度為2 μg/mL的VP60 VLPs溶液混合，37℃孵育1.5 h，得到待檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的預(yù)處理液；

2）在檢測板的待檢血清孔、陽性對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔中分別加入100 μL待檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的預(yù)處理液，37℃孵育1.5 h，采用洗滌液洗滌；

3）將單克隆抗體1B8，加入酶標(biāo)板中，100 μL /孔，37℃孵育1 h，采用洗滌液洗滌；

4）加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，100 μL /孔，37℃孵育1 h，采用洗滌液洗滌（PBST洗滌5次，每次5 min）；

5）加顯色液，100 μL /孔，避光反應(yīng)10min進(jìn)行顯色；

6）每孔加入50 μL終止液；

7）采用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光值OD_450nm，按照如下公式計(jì)算阻斷率PI：

阻斷率PI=(陰性對(duì)照孔OD_450nm-待檢血清孔OD_450nm) /陰性對(duì)照孔OD_450nm100%；

判定標(biāo)準(zhǔn)如下：當(dāng)阻斷率PI≥30.99%時(shí)判定為血清陽性反應(yīng)，兔病毒性出血癥疫苗免疫后可以保護(hù)病毒攻擊；當(dāng)PI≤25.3%時(shí)，判定為血清抗體陰性反應(yīng)，兔病毒性出血癥疫苗免疫后不能保護(hù)病毒的攻擊；當(dāng)25.3%＜PI＜30.99%時(shí)判定為可疑，重復(fù)檢測一次，如果PI仍然低于30.99%則判定為血清抗體陰性，兔病毒性出血癥疫苗免疫后不能保護(hù)病毒的攻擊。