[發(fā)明專利]高粱花葉病毒間接ELISA檢測方法及其試劑盒與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710541163.4
• 申請日: 2017-07-05
• 公開（公告）號: CN107290532B
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳保善;溫榮輝;王鳳林;黃增飛;李書巧
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

1.一種高粱花葉病毒間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于包括特異性識別高粱花葉病毒的兔抗多克隆抗體和辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔lgG標(biāo)準(zhǔn)液；所述多克隆抗體以甘蔗高粱花葉病毒的P3蛋白N端保守區(qū)多肽為抗原制備；所述制備按以下操作進行：從NCBI網(wǎng)站獲得SrMV的P3基因序列，預(yù)測P3蛋白的氨基酸序列，選取N端暴露于天然蛋白外表的多肽為抗原，合成該多肽，將此多肽與弗氏佐劑混合免疫兔子，采集兔子血液，經(jīng)親和層析純化獲得多克隆抗體；所述多肽為序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。

2.使用權(quán)利要求1所述試劑盒的高粱花葉病毒間接ELISA檢測方法，其特征在于以所述兔抗多克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔lgG標(biāo)準(zhǔn)液作為二抗對甘蔗中的高粱花葉病毒進行ELISA檢測。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高粱花葉病毒間接ELISA檢測方法，其特征在于按以下步驟進行操作：

A.樣品處理：稱取待檢甘蔗樣品，將其制成勻漿，離心或靜置沉淀，取上清液用包被緩沖液稀釋2-8倍備用；

B.樣品包被：取100μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的檢測樣品液加入96孔酶標(biāo)板中，以SrMV抗原標(biāo)準(zhǔn)液為陽性對照，以健康甘蔗樣品液為陰性對照，在37℃條件下包被1-2h；

C.洗滌：去除酶標(biāo)板中的包被液，每孔加入100μL PBST緩沖液漂洗3次，每次5min；

D.封閉：去除酶標(biāo)板中的PBST緩沖液，每孔加入100μL封閉液，37℃孵育1h，去除封閉液后用PBST緩沖液漂洗3次，每次5min；

E.抗體孵育：每孔加入100μL 1:1000稀釋的所述兔抗多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)液，37℃孵育1h，漂洗3次；再每孔加入100μL 1:8000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG標(biāo)準(zhǔn)液，37℃孵育1h，去除二抗，用PBST緩沖液漂洗3次，每次5min；

F.底物顯色及終止反應(yīng)：每孔加入100μL可溶性型TMB底物顯色液，37℃避光顯色10min，溶液顯藍色，每孔加入50μL 2M的H₂SO4終止反應(yīng)，溶液變?yōu)辄S色；

G.結(jié)果判定：用酶標(biāo)儀測定OD₄₅₀，計算P/N值；如果P/N＞2.1則待測樣為陽性；反之則為陰性。

4.權(quán)利要求1所述高粱花葉病毒間接ELISA檢測試劑盒用于甘蔗中高粱花葉病毒的ELISA檢測的用途。