[發明專利]高粱花葉病毒間接ELISA檢測方法及其試劑盒與應用

有效

• 申請號: 201710541163.4
• 申請日: 2017-07-05
• 公開（公告）號: CN107290532B
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 陳保善;溫榮輝;王鳳林;黃增飛;李書巧
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

本發明公開了一種甘蔗中的高粱花葉病毒間接ELISA檢測試劑盒，主要包括特異性識別高粱花葉病毒的兔抗多克隆抗體和辣根過氧化酶標記的羊抗兔lgG標準液。其中，多克隆抗體以甘蔗高粱花葉病毒的P3蛋白N端保守區多肽為抗原制備。據此，發明人還建立了相應的間接ELISA檢測方法，并將之用于甘蔗中的高粱花葉病毒檢測。與現有技術相比，本發明具有靈敏度高、特異性強、成本低、高通量、檢測快速的優點，既適用于田間對少量樣品的快速檢測，也適用于實驗室內的大量樣品的高通量快速檢測。

技術領域

本發明屬于高粱花葉病毒檢測領域，尤其涉及一種高粱花葉病毒間接ELISA檢測方法及其試劑盒與應用。

背景技術

甘蔗是世界上最重要的糖料作物，也是最具潛力的可再生能源作物。甘蔗生長過程中會受到病毒的危害，且經過長期無性繁殖，多種病毒會積累在不同甘蔗品種及種質材料中，導致其種性退化，產量和品質下降，給甘蔗產業帶來嚴重損失。

甘蔗花葉病是甘蔗主要病害之一，其主要病原是馬鈴薯Y病毒屬甘蔗花葉病毒亞組的甘蔗高粱花葉病毒(SrMV)，該病毒可經蚜蟲叮咬和機械損傷進行近距離傳播，其自然寄主為禾本科的高粱和甘蔗等。甘蔗主要通過種莖進行無性繁殖，會造成該病毒的積累和遠距離傳播。被感染植株的葉面會出現黃綠相間不規則的嵌紋、條斑或斑駁，葉色褪綠等癥狀，病狀在幼嫩葉片的基部較明顯，影響光合作用的效率，會造成甘蔗產量和含糖量下降。因此，建立一種操作簡單、特異靈敏、成本低廉的SrMV高效檢測方法，對田間病毒調查，防止該病毒傳播，以及建立無毒甘蔗種苗體系等具有重要意義。

目前檢測病毒常用的方法可分為分子檢測技術和血清學檢測技術兩類。分子檢測技術是一種基于核酸水平的檢測，具有準確高效、靈敏快速的特點，但操作比較復雜，成本很高。常見的SrMV檢測方法為PCR檢測技術，首先需要對甘蔗提取總RNA，反轉錄為cDNA，再進行PCR擴增，最后進行電泳分析，甚至還要進行基因組序列測定。PCR技術操作過程繁瑣、耗時長，并且該技術完全依賴于PCR儀器和商業化的試劑，所以實驗成本較高，不利于田間病毒病的大規模檢測。此外，PCR技術假陽性較高，整個過程需要專業人員操作，難以普及推廣。

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是一種免疫學檢測方法，具有靈敏度高、操作方便且經濟實用的特點，其極大地克服了RT-PCR存在的缺點，不需要提取核酸，也不容易交叉污染，適合于田間或出入境口岸大規模樣品檢測，因而越來越受到人們的青睞和重視。目前ELISA技術在甘蔗病毒檢測方面還不成熟，還難以應用于田間病害調查以及健康甘蔗種苗選育。目前，國內還沒有商業化檢測甘蔗病毒的ELISA試劑盒，這既是一研究熱點，也是一研發目標，其技術的關鍵在于制備高質量的檢測抗體。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種靈敏度高、特異性強、成本低、高通量、檢測快速的高粱花葉病毒間接ELISA檢測方法及其試劑盒與應用。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：高粱花葉病毒間接ELISA檢測試劑盒，主要包括特異性識別高粱花葉病毒的兔抗多克隆抗體和辣根過氧化酶標記的羊抗兔lgG標準液。

多克隆抗體以甘蔗高粱花葉病毒的P3蛋白N端保守區多肽為抗原制備。

制備按以下操作進行：從NCBI網站獲得SrMV的P3基因序列，預測P3蛋白的氨基酸序列，選取N端暴露于天然蛋白外表的多肽為抗原，合成該多肽，將此多肽與弗氏佐劑混合免疫兔子，采集兔子血液，經親和層析純化獲得多克隆抗體。

多肽具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。

高粱花葉病毒間接ELISA檢測方法，以兔抗的甘蔗高粱花葉病毒P3蛋白N端保守區制備的多克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標記的羊抗兔lgG標準液作為二抗對甘蔗中的高粱花葉病毒進行ELISA檢測。

上述高粱花葉病毒間接ELISA檢測方法，按以下步驟進行操作：