[發明專利]鴨源性成分PCR檢測用陽性標準分子、制備及檢測方法

在審

• 申請號: 201710538286.2
• 申請日: 2017-07-04
• 公開（公告）號: CN107312840A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 霍勝楠;鄭世超;張然
• 申請（專利權）人: 山東省食品藥品檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所37218
• 代理人: 李桂存

1.一種鴨源性成分PCR檢測用陽性標準分子，其特征在于，所述陽性標準分子為能夠自主復制的質粒分子，所述質粒分子中包含鴨18SrRNA基因序列和鴨線粒體基因序列。

2.一種如權利要求1所述的陽性標準分子的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

（1）分別設計鴨18SrRNA基因序列的擴增引物18S-F、18S-R和鴨線粒體基因序列的擴增引物ANAS-F、ANAS-R；

鴨18SrRNA基因序列的擴增引物18S-F、18S-R為：

18S-F ：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3'，

18S-R ：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'；

鴨線粒體基因序列的擴增引物ANAS-F、ANAS-R為：

ANAS-F：5'-CCATGAAGCCCCATTCTCA-3'，

ANAS-R：5'-CCGGTGGCAACAAAGAAAGT-3' ；

（2）以鴨基因組為模板基因組，用所述鴨18SrRNA基因序列的擴增引物和鴨線粒體基因序列的擴增引物，進行PCR擴增，得到鴨18SrRNA基因序列和鴨線粒體基因序列；

（3）將所述鴨18SrRNA基因序列和鴨線粒體序列分別連接至pMD18-T載體，得到鴨18SrRNA重組子和鴨線粒體重組子；

（4）將所述鴨18SrRNA重組子和鴨線粒體重組子通過限制性內切酶酶切并拼接，得到陽性標準分子。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述限制性內切酶為Sal I酶和PstI酶。

4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中，所述PCR擴增的反應體系為10uM上游引物1μL，10uM下游引物1μL，模板基因組3μL，Taq酶12.5μL，加ddH₂O調整反應體系的體積為25μL；所述PCR擴增的反應條件為94℃變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行40次循環，得到PCR產物；

將所述PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，目的產物用膠回收試劑盒純化，得到PCR純化產物，即為鴨18SrRNA基因序列和鴨線粒體基因序列。

5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（3）中，將所述鴨18SrRNA基因序列和鴨線粒體基因序列分別與pMD18-T載體進行連接，4℃下過夜連接，得到鴨18SrRNA重組子18S-pMD18-T和鴨線粒體重組子ANAS-pMD18-T。

6.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（4）中，將所述鴨18SrRNA重組子和鴨線粒體重組子分別用Sal I酶和PstI酶進行雙酶切，37℃水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，將回收片段連接，4度過夜連接，搖床均勻混勻2小時進行質粒轉化，得到轉化質粒；

將所述轉化質粒進行凝膠電泳分離，回收大分子質粒條帶進行重組克隆質粒篩選回收，得到重組克隆；

將所述重組克隆通過常規PCR 驗證、Sal I 和Pst I 的酶切驗證及酶切產物測序驗證，得到的質粒分子18S-ANAS-pMD18-T即為陽性標準分子。

7.一種如權利要求1所述的陽性標準分子的檢測方法，其特征在于，利用特異性檢測引物和探針，以所述陽性標準分子為模板進行實時熒光PCR反應，所述特異性檢測引物和探針包括以下兩組：

鴨18SrRNA基因序列的特異性檢測引物18S-F、18S-R和探針18S-P：

18S-F：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3' ，

18S-R：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'，

18S-P：5'-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3'；

鴨線粒體基因序列的特異性檢測引物ANAS-F、ANAS-R和探針ANAS-P：

ANAS-F：5'-CCATGAAGCCCCATTCTCA-3'，

ANAS-R：5'-CCGGTGGCAACAAAGAAAGT-3' ，

ANAS-P：5'-TCGCCGACAGCGTCTACGGCT-3'。

8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述探針的5'端修飾有熒光報告基團，3'端修飾有熒光淬滅基團。