[發明專利]鴨源性成分PCR檢測用陽性標準分子、制備及檢測方法

在審

• 申請號: 201710538286.2
• 申請日: 2017-07-04
• 公開（公告）號: CN107312840A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 霍勝楠;鄭世超;張然
• 申請（專利權）人: 山東省食品藥品檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所37218
• 代理人: 李桂存

技術領域

本發明屬于生物工程領域，尤其涉及一種鴨源性成分PCR檢測用陽性標準分子、制備及檢測方法。

背景技術

隨著生活水平的不斷提高，人們對食品質量安全的重視程度也相應提高。一些不法分子為牟取暴利，低價購入不明動物源的劣質肉用以制作肉制品，或使用香精等制作假冒肉制品，嚴重擾亂肉制品市場，損害消費者正當權益，帶來極大的安全隱患。因此，加強肉制品檢測，準確檢測出食品中相應動物源成分的含量，是防治劣質肉制品流入市場的關鍵措施。

熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction ，FQ-PCR)方法是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術的一種，是公認的目前核酸檢測的最常用定量檢測方法。實時熒光定量PCR技術在PCR反應體系中加入能特異標記PCR產物的熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對樣品進行定量分析，實現了PCR技術由定性到定量的飛躍。

使用FQ-PCR技術對樣品進行檢測時需要陽性參考物質作為對照，以保證實驗結果的可靠性。因此，陽性參考物質的質量與實驗結果的準確性密切相關?，F階段，對于動物源性成分的檢測過程中所用的陽性參考物質通常是動物基因組DNA。其中，鴨成分檢測過程中，提取鴨基因組DNA過程復雜，制備非常不方便。由于鴨基因組DNA的穩定性不能滿足長期貯存及經常性使用的需要，因此，每次進行鴨成分檢測時，都需要重新制備鴨基因組DNA作為陽性參考物質，影響鴨成分測量的穩定性。

發明內容

本發明提供了鴨源性成分PCR檢測用陽性標準分子、制備及檢測方法，以解決PCR檢測過程中陽性參考物質制備復雜、儲存困難的問題。

第一方面，本發明提供了一種鴨源性成分PCR檢測用陽性標準分子，為能夠自主復制的質粒分子，所述質粒分子中包含鴨18SrRNA基因序列和鴨線粒體基因序列。

第二方面，本發明還提供了一種用以制備第一方面所述陽性標準分子的制備方法，包括以下步驟：

（1）分別設計鴨18SrRNA基因序列的擴增引物18S-F、18S-R和鴨線粒體基因序列的擴增引物ANAS-F、ANAS-R；

鴨18SrRNA基因序列的擴增引物18S-F、18S-R為：

18S-F ：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3'，

18S-R ：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'；

鴨線粒體基因序列的擴增引物ANAS-F、ANAS-R為：

ANAS-F：5'-CCATGAAGCCCCATTCTCA-3'，

ANAS-R：5'-CCGGTGGCAACAAAGAAAGT-3'；

（2）以鴨基因組為模板基因組，用鴨18SrRNA基因序列的擴增引物和鴨線粒體基因序列的擴增引物，進行PCR擴增，得到鴨18SrRNA基因序列和鴨線粒體基因序列；

（3）將鴨18SrRNA基因序列和鴨線粒體序列分別連接至pMD18-T載體，得到鴨18SrRNA重組子和鴨線粒體重組子；

（4）將鴨18SrRNA重組子和鴨線粒體重組子通過限制性內切酶酶切并拼接，得到陽性標準分子。

可選地，所述限制性內切酶為Sal I酶和PstI酶。

可選地，步驟（2）中， PCR擴增的反應體系為10uM上游引物1μL，10uM下游引物1μL，模板基因組3μL，Taq酶12.5μL，加ddH₂O調整反應體系的體積為25μL；所述PCR擴增的反應條件為94℃變性5 min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進行40次循環，得到PCR產物；

將PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，目的產物用膠回收試劑盒純化，得到PCR純化產物，即為鴨18SrRNA基因序列和鴨線粒體基因序列。

可選地，步驟（3）中，將鴨18SrRNA基因序列和鴨線粒體基因序列分別與pMD18-T載體進行連接，4℃下過夜連接，得到鴨18SrRNA重組子18S-pMD18-T和鴨線粒體重組子ANAS-pMD18-T。