[發明專利]一種動物角膜長期培養評價眼刺激性損傷及修復的方法

有效

• 申請號: 201710538216.7
• 申請日: 2017-07-04
• 公開（公告）號: CN107796674B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 程樹軍;劉超;秦瑤
• 申請（專利權）人: 程樹軍;廣州市華代生物科技有限公司
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N27/04;G01N27/20;G01N33/50;G01N33/533;C12N5/071;C12N5/079;C12Q1/02
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 周克佑

一種利用動物離體角膜長期培養模型評價眼刺激性損傷及修復作用評估的方法，包括以下步驟：1.離體角膜制備；2.角膜長期培養；3.角膜化學損傷模型及評價；4.角膜物理損傷模型及評價；5.角膜損傷后修復作用評估；6.統計分析與結果判定。本發明利用外源刺激物，如化學物質、紫外線引起可逆性的角膜上皮細胞變性和基質損傷，通過預測模型，評估眼刺激性的程度；或者是利用化學方法、物理方法或機械方法造成角膜上皮細胞和基質的可逆性刺激、輕微磨損或缺失損傷，評估損傷后角膜的自身修復，或者損傷發生后添加藥物評價藥物促進角膜修復作用的方法。本方法操作簡單，與體內實驗相關性好，敏感程度高，能滿足角膜刺激性損傷及其修復的檢測和研究的需要。

技術領域

本發明涉及一種應用于化學品、化妝品、農藥和藥品眼刺激性及恢復的毒理學和藥理學實驗評價的利用動物如豬或牛等離體角膜長期培養模型評價眼刺激性損傷及修復作用評估的方法。

背景技術

許多外源化學物質，如化妝品、藥品、農藥和大氣污染物等，有可能會接觸到眼睛造成人體眼睛的健康危害。所以，檢測和評估藥品、日用消費品(如個人護理品、家居化學品、清潔消毒產品等)、環境污染物(如農藥、煙塵、顆粒物、花粉等)潛在眼刺激性成為保障人身安全的重要內容。眼刺激試驗是眼部接觸產品上市前安全評價的強制檢驗項目，也是化學品標識和分類的強制要求，其目的是采用科學方法檢測和判斷產品安全性以減少人類健康風險。因此對待測物的快速分類和危害識別是風險決策的首要任務。對于眼刺激物的毒理學評價，傳統方法沿用1944年Draize提出的兔眼刺激體內實驗，兔眼實驗的缺點包括動物遭受極大痛苦、試驗周期長、檢驗成本高、結果判定主觀性強、動物與人體反應存在差異等。

另一方面，臨床常見的角膜外傷性或機械性損傷的治療，或手術后(如角膜異物剔除術后、準分子術后或白內障術后)通常需要使用一些藥物促進角膜愈合，對這些藥物是否具有刺激性，及其促進角膜修復作用的觀察也是藥理研究的基本要求。傳統的評價方法通常使用活體動物，造成角膜缺損或刺激性損傷模型，然后通過施加藥物后檢查角膜形態、結構和功能，評估藥物的作用。動物實驗普遍存在動物極其痛苦、試驗周期長、手術穩定性差、研究成本高、與人體反應存在差異等不足。

隨著生命科學研究和檢驗檢測中“3R原則”，即減少(reduction)、代替(replacement)和優化(refinement)動物實驗原則的國際化，特別是“21世紀毒性測試愿景”的提出和新技術的發展，不再以動物模式為基礎的測試系統已成為科學研究的熱點，一些檢測和評估的方法已被許多國家的法規所接受。如歐盟化妝品法規《1223/2009/EC》對于化妝品動物實驗的禁止，歐盟化學品REACH法規《1907/2006/EC》 (化學品的注冊、評估、許可和限制)鼓勵動物試驗替代方法的開發和應用。采用體外實驗系統和方法進行眼刺激性評價已取得極大成功，對于急性刺激和腐蝕性的測試，經濟合作的發展組織(OECD)已確認和認可了一些方法，包括離體牛角膜的方法，角膜細胞的短期暴露方法，上皮細胞的熒光素漏出法和重建角膜模型的方法等。如何合理科學地使用這些方法，并在此基礎上進一步創新新的測試系統和評估方法，解決現有方法和不足，仍然是眼科毒理學和藥理學評價的主要研究內容。

根據體內眼損傷發生的機理，目前開發中的眼刺激替代方法可分為細胞系統、雞胚、人工角膜和離體器官四類，這幾類方法各有其優缺點和適用范圍。細胞系統標準化程度最高、成本低、快速，但只適用于可溶解物質的測試。雞胚方法的標準化程度不高，適合模擬結膜的損傷，而對角膜損傷預測不佳。體外重建的人工角膜缺少角膜內皮細胞層、構建成本高，操作難度大。而且，上述這些方法都不能用于角膜損傷后恢復作用的研究和測試，因為有些輕微刺激性的物質可造成角膜的短暫可逆性損傷，只有體外培養時間較長的試驗系統才能檢測這種作用。此外，對于各種原因導致的角膜機械性損傷，如角膜上皮擦傷(如指甲、樹枝、隱形眼鏡等異物劃傷)、角膜異物傷(如鐵屑、谷殼、風沙、灰塵等)、角膜手術(如激光治療近視眼、微創切除)，也需要開發促進角膜修復的藥物并研究其作用機制。而采用單層細胞培養、雞胚培養或人工角膜等體外方法均不能模擬角膜的完整結構和機械性損傷。