[發明專利]一種動物角膜長期培養評價眼刺激性損傷及修復的方法

有效

• 申請號: 201710538216.7
• 申請日: 2017-07-04
• 公開（公告）號: CN107796674B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 程樹軍;劉超;秦瑤
• 申請（專利權）人: 程樹軍;廣州市華代生物科技有限公司
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N27/04;G01N27/20;G01N33/50;G01N33/533;C12N5/071;C12N5/079;C12Q1/02
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 周克佑

1.一種動物角膜長期培養評價眼刺激性損傷及修復的方法，其特征是包括以下步驟：

步驟1.離體角膜制備；

步驟2.角膜長期培養：

取清洗干凈的角膜，上皮面朝下懸浮于添加有HBSS液的6孔板、12孔板或直徑35 mm的培養皿，使角膜完全浸沒于培養液；

將融解狀態的0.5-5%的瓊脂-明膠-M199混合物,緩慢逐滴每次2-3滴加入角膜窩內皮面，直至內皮窩完全填滿，瓊脂-明膠-M199混合物在室溫下完全凝固；

將充滿凝固的瓊脂-明膠-M199混合物的角膜倒置，轉移到若干35 mm培養皿中；

吸取40-60ml的M199培養基加入每個培養皿中，直到覆蓋角膜緣，裸露角膜上皮面暴露于空氣中；

將培養皿置于小型振蕩器上，置于32^oC±2^oC、5%CO₂、90%相對濕度的培養箱中培養8-24h，小型振蕩器應使培養皿在每2h-3h內從水平位置搖動到45°角，使得角膜可以短暫浸泡在培養基中浸潤上皮組織；

步驟3.角膜化學損傷模型及評價；

步驟4.角膜物理損傷模型及評價；

步驟5.角膜損傷后修復作用評估：

（1）化合物損傷角膜后，將角膜轉移到新的培養皿中，取40ml新的M199培養基加入每個培養皿中，后孵育2小時；更換含有活性物質表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子或維生素的M199培養基，置于32^oC ±2^oC、5% CO₂、90% 相對濕度的培養箱，按步驟2角膜長期培養方法繼續培養至第14天；實驗組平行樣20-30個；含活性物質的M199培養基為活性修復組，不含活性物質的M199培養基為自然修復組，同時設空白對照或基準對照；

（2）培養期間，每2天更換含活性物質的M199培養液；分別于化學損傷后的第2h、14h、26h、38h、50h、62h、74h、86h、98h、110、170h和14d±2h的時間點，取培養液進行細胞因子測試，并取實驗組其中2-3只角膜進行濁度測試、電阻測試、熒光素評分和組織學觀察，其余角膜繼續培養；

（3）角膜液細胞因子測試：在更換新的培養液前，從培養皿中移出培養液，檢測培養液中的炎性因子和修復因子水平：包括IL-1a、IL-6、IL-8；

（4）濁度變化：濁度檢測前，從培養皿中取出角膜，將其固定于夾持器中，夾持器的后室和前室分別依次填充無菌不含酚紅的MEM培養基，用角膜濁度儀測量并記錄每個角膜的濁度值，來自不同組的角膜分別記錄濁度值，OP_活性h，OP_修復h，OP_空白；計算實驗組與空白組的濁度差值；

（5）電阻測定和熒光素觀察：測完濁度后，用電阻儀測定角膜的電阻值；然后從夾持器中取下角膜，上表面滴入含2% 熒光素鈉NaFL的PBS；過量的NaFL立即用PBS沖洗，在紫外燈下觀察NaFL的潴留，潴留的程度表明角膜損傷的嚴重性；

計算潴留面積S占整個角膜面積C的百分比值，根據S/C值對損傷/恢復程度進行評分；0分：2%，1分：2～25%， 2分：26～50%，3分：51～75%，4分：76%～100%；

（6）組織學評價：熒光素評分完成后，取角膜加入10%中性福爾馬林緩沖液中固定24h；石蠟包埋、切片、取部分切片進行HE染色；顯微鏡下觀察并評估組織學變化；

取部分切片進行免疫組化染色：角膜上皮細胞緊密連接蛋白Occludin或ZO-1的染色或鈣粘連蛋白染色，用于觀察角膜修復過程中，上皮屏障功能的改善情況；

步驟6.統計分析與結果判定

將上述步驟獲得的各組實驗數據，以均數±標準差表示，采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析，多組之間差異的比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗法，顯著性水平α=0.05，p＜0.05表示差異具有統計學意義；

化學損傷后修復綜合分析角膜電阻值、熒光素染色、濁度測試、炎性因子檢測和組織學觀察結果；機械損傷修復不進行電阻測試和濁度測試；紫外線損傷后修復參考化學損傷；

根據不同檢測參數的意義，從統計結果分析，作出修復作用的綜合判斷：

（1）電阻測定和熒光素染色：隨著培養時間的延長，自然修復組和活性修復組電阻值逐漸升高；熒光素染色的S/C的比值逐漸下降，評分降低；自然修復組和活性修復組與空白對照相比，S/C的比值具有統計學差異p＜0.05；活性修復組與自然修復組相比，電阻值的增高具有統計學意義，熒光素滯留的評分值相差1級以上，認為活性物質對修復有促進作用；

（2）濁度測試：隨著培養時間的延長，自然修復組和活性修復組濁度OP的值逐漸下降；修復組與空白對照相比的濁度差值逐漸縮小；活性修復組與自然修復組相比，2個時間點以上，濁度差值相比具有統計學差異p＜0.05，認為活性物質對修復有促進作用；

（3）炎性因子檢測：隨著培養時間的延長，自然修復組和活性修復組炎性因子的數值應呈下降或升高趨勢，且具有統計學差異p＜0.05；同一時間下，活性修復組與自然修復組相比，特征性炎性因子或修復因子的水平具有統計學差異，提示活性物質對修復有促進作用；

（4）組織學觀察：通過HE染色和免疫組化染色，觀察角膜的組織學變化，并詳細記錄：

角膜化學刺激性損傷發生后，組織學表現為上皮的明顯缺損，上皮細胞缺失、通透性增加，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin結構消失；隨時間推移，上皮細胞增殖并向缺損處遷徙，其通透性逐漸降低，緊密連接蛋白結構逐漸形成；24h時后，上皮細胞覆蓋角膜上皮缺損處，但其通透性仍較正常組高，其細胞間緊密連接松散、排列紊亂；48h后，角膜通透性恢復正常，其角膜上皮細胞連接緊密，細胞間形成緊密連接結構；如果促進修復組與自然修復組相比，組織學修復時間縮短12h以上或修復程度提高，即相似組織學結構和特征觀察的時間提前12小時以上，提示活性物質對修復有促進作用；

步驟4物理刺激損傷角膜模型及評價包括以下子步驟：

（1）角膜培養24h后，從培養皿中吸出培養液；把直徑1.0cm的聚四氟乙烯樹脂O-形環置于角膜；用無菌的眼科手術刀片在眼角膜中央刮除直徑為8mm的角膜中央上皮，深及角膜上皮細胞基底層，制備機械性角膜損傷模型；每個損傷模型使用6-10個角膜；每個模型取其中的2只角膜進行如下刺激程度評估測試：

（2）熒光素觀察：同步驟5之（5）；NaFL染色顯示損傷的角膜，黃色區域的大小表示損傷的嚴重程度；

（3）物理刺激模型引進的組織學評價：同步驟5之（6）；

（4）物理損傷角膜評價：

熒光素染色評分若不滿足損傷面積＞50%，小于75%，則認為損傷程度過于嚴重，不能用于損傷修復評估；

組織學檢查：角膜損傷后，出現上皮的明顯缺損，表現為上皮細胞缺失，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin結構消失；基質層上層斷裂或缺失，物理因素導致的組織學損傷應與熒光素染色對應；

（5）剩余的角膜浸沒于含有40-60ml M199培養基的培養皿中，置于32^oC±2^oC、5%CO₂、90%相對濕度的培養箱，按步驟2角膜長期培養方法繼續培養，進行后續自然修復或促進修復作用研究；

（6）同時設置陰性對照，陰性對照為去離子水，均采用相同的操作步驟。