[發明專利]衍生化HPLC－DAD法測定藥物中小分子脂肪胺的方法

在審

• 申請號: 201710530254.8
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107085068A
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發明（設計）人: 鄭楓;柳文媛;馮鋒;侯德勝;韓凌飛;周潔
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于藥品分析檢測領域，涉及衍生化HPLC-DAD法測定小分子脂肪胺的方法，尤其涉及衍生化HPLC-DAD法測定藥物中小分子脂肪胺的方法。

背景技術

小分子有機胺是指有機類物質與氨發生化學反應生成的小分子有機化合物。除了工業生產外，蛋白質、氨基酸和其它含氮化合物通過微生物發酵降解也會產生相應的小分子有機胺。小分子有機胺因具有較強的堿性和反應活性，在化工和制藥領域應用廣泛，經常作為藥物合成中的有機溶劑、原料和中間體。胺類物質往往具有魚腥氣味或氨的刺激氣味，對皮膚、呼吸道、黏膜及眼睛具有強烈刺激作用；而且大部分都有毒性，有的甚至是“三致”物質：文獻表明，仲胺(二甲胺、二乙胺等)可與體內存在的亞硝酸根離子反應形成致癌的亞硝胺，從而對人體健康造成威脅。另外，臨床上將檢測二甲胺的含量作為診斷遺傳性代謝性紊亂疾病的重要指標。為了保證藥品的安全性，應嚴格對藥品合成過程中可能引入的相關雜質進行質量控制。因此建立高效、簡便而靈敏的分析方法對藥品中的這類物質進行監控顯得尤為重要。

藥物中小分子脂肪胺的分析方法的建立存在著諸多的挑戰。首先，小分子脂肪胺極性大，揮發性強，結構上缺少紫外發色團或熒光基團，采用一般的分析方法難以對其進行檢測；其次，大量藥物基質的存在勢必產生較強的干擾，因此要求分析方法應具有極高的專屬性和靈敏度；再者，由于基質成分的復雜性，藥物分析時無法經歷復雜的濃縮富集過程以防止藥物析出結晶；最后，藥品檢驗是常規工作，不能使用昂貴的試劑或繁瑣的前處理操作，且最好使用常規的分析儀器以增加方法的普適性。

目前已報道的測定微量脂肪胺的分析方法很多，包括分光光度法、氣相色譜法、離子色譜法、衍生化法等，主要針對于環境樣本。夏濤將水樣中的二甲胺與氯化銅及二硫化碳反應生成黃棕色二甲氨基二硫代甲酸銅，在430nm處測量溶液的吸光度，比色定量。分光光度法操作簡便，但是只能測定總胺的含量，專屬性差。氣相色譜法結合不同的前處理技術(固相微萃取技術、頂空進樣技術和溶劑棒微萃取技術)被報道用于水環境中脂肪胺的測定，這些方法經濃縮富集之后直接分析，無須衍生化，靈敏度高；然而胺分子極性大，容易吸附在硅烷和硅氧烷等極性固定相上，造成峰拖尾，重復性差。Ferreira等建立了蒸餾提取-離子色譜法測定海水中殘留的銨根離子、甲胺和乙胺，方法的檢測限低，回收率良好。然而，考慮到藥物合成中存在大量的反簇離子會對實驗結果造成干擾，且離子色譜法在藥物分析中普適性差，因此并非測定胺類物質的最佳方案。

衍生化法也是測定微量有機胺最常用的分析方法，目前有關胺類物質衍生化法的報道較多，包括衍生化氣質聯用法、衍生化高效液相色譜法、衍生化毛細管電泳法以及衍生化液質聯用法等，這促使了很多衍生化試劑的誕生和發展。氯甲酸-9-芴甲酯、丹磺酰氯、叔丁基溴乙酸乙酯、五氟苯甲醛、1，3，5，7-四甲基-8-(N-羥基琥珀酰亞胺基丁酸酯)-二氟硼酸基-s-吲丹烯等均被用于胺類物質的衍生化分析中。這些衍生化試劑雖然在一定程度上緩解了微量胺類物質難以測定的問題，卻存在著不同程度的缺陷，包括基質效應大、衍生化試劑干擾、靈敏度低、選擇性差、反應條件苛刻、衍生化試劑難以商品化等。其中過量未反應衍生化試劑的干擾已成為困擾分析學者的主要矛盾之一。衍生化試劑與產物往往具有相似的結構，為了去除過量的衍生化試劑，經常需要結合繁瑣的前處理步驟，或者摸索復雜的色譜條件。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供衍生化HPLC-DAD法測定小分子脂肪胺的方法。

本發明的另一目的是提供衍生化HPLC-DAD法測定藥品中小分子脂肪胺的方法。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

衍生化HPLC-DAD法測定小分子脂肪胺的方法，包含以下步驟：

(1)在20～60℃下，以非質子極性溶劑為反應溶劑，在弱堿催化劑的催化作用下，使用鹵代硝基苯類衍生化試劑對小分子脂肪胺衍生化反應生成在紫外可見光區(350～450nm)有較強的吸收的產物；

(2)以步驟(1)中衍生化反應結束后的反應液作為進樣樣品，利用HPLC-DAD法，基于反相分配色譜法原理在紫外可見光區(350～450nm)測定其中脂肪胺的衍生化產物，從而實現對小分子脂肪胺的定性或定量檢測。