[發明專利]衍生化HPLC－DAD法測定藥物中小分子脂肪胺的方法

在審

• 申請號: 201710530254.8
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107085068A
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發明（設計）人: 鄭楓;柳文媛;馮鋒;侯德勝;韓凌飛;周潔
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.衍生化HPLC-DAD法測定小分子脂肪胺的方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)在20～60℃下，以非質子極性溶劑為反應溶劑，在弱堿催化劑的催化作用下，使用鹵代硝基苯類衍生化試劑對小分子脂肪胺衍生化反應生成在紫外可見光區350～450nm有較強的吸收的產物；

(2)以步驟(1)中衍生化反應結束后的反應液作為進樣樣品，利用HPLC-DAD法，基于反相分配色譜法原理在紫外可見光區350～450nm測定其中脂肪胺的衍生化產物，從而實現對小分子脂肪胺的定性或定量檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的小分子脂肪胺選自如式R₁NH₂所示的伯胺、如式R₂R₃NH所示的仲胺、含1或2個N的五元或六元飽和或不飽和雜環，其中，R₁、R₂、R₃分別獨立的選自C1～C6的烷基；

所述的鹵代硝基苯類衍生化試劑選自2-硝基氟苯、4-硝基氟苯、4-硝基氯苯、2，4-二硝基氟苯、2，6-二硝基氯苯、2-硝基-4-三氟甲基氟苯中的任意一種；

所述的弱堿催化劑選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、乙酸鈉、三乙胺、N，N-二異丙基乙胺中的任意一種；

所述的非質子極性溶劑選自二甲亞砜、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺中的任意一種。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的小分子脂肪胺選自甲胺、二甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、丁胺、吡咯烷或哌啶中的任意一種；

所述的鹵代硝基苯類衍生化試劑選自2-硝基-4-三氟甲基氟苯；

所述的弱堿催化劑選自N，N-二異丙基乙胺；

所述的非質子極性溶劑選自二甲亞砜。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的衍生化反應的條件為：在常溫20～30℃下，以二甲亞砜為反應溶劑，2-硝基-4-三氟甲基氟苯濃度為0.10～0.20mg/mL，1.5％N，N-二異丙基乙胺60～240μL，反應時間為0.5～2h。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述的衍生化反應的條件為：在常溫下，以二甲亞砜為反應溶劑，2-硝基-4-三氟甲基氟苯濃度為0.15mg/mL，1.5％N，N-二異丙基乙胺150μL，反應時間為1.5h。

6.權利要求1～5中任一項所述的方法在測定藥物中小分子脂肪胺中的應用。

7.衍生化HPLC-DAD法測定藥物中小分子脂肪胺的方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)20～60℃下，以二甲亞砜為反應溶劑，在N，N-二異丙基乙胺的催化作用下，使用2-硝基-4-三氟甲基氟苯對待測藥物衍生化反應0.5～2h；

(2)以步驟(1)中衍生化反應結束后的反應液作為進樣樣品，利用HPLC-DAD法在350～450nm測定其中小分子脂肪胺的衍生化產物，從而實現對藥物中小分子脂肪胺的定性或定量檢測。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述的小分子脂肪胺選自如式R₁NH₂所示的伯胺、如式R₂R₃NH所示的仲胺、含1或2個N的五元或六元飽和或不飽和雜環，其中，R₁、R₂、R₃分別獨立的選自C1～C6的烷基；優選自甲胺、二甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、丁胺、吡咯烷或哌啶中的任意一種。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述的衍生化反應的條件：在常溫20～30℃下，以二甲亞砜為反應溶劑，2-硝基-4-三氟甲基氟苯濃度為0.10～0.20mg/mL，1.5％ N，N-二異丙基乙胺60～240μL，反應時間為0.5～2h；優選的，所述的衍生化反應的條件：在常溫下，2-硝基-4-三氟甲基氟苯濃度為0.15mg/mL，1.5％ N，N-二異丙基乙胺150μL，反應時間為1.5h。

10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述的HPLC-DAD法采用HPLC色譜儀；采用反相分配色譜法；以非極性鍵合相為固定相，采用極性流動相，檢測波長位于350～450nm之間，進一步優選位于350～440nm之間，最優選為400～440nm；優選的，所述的HPLC-DAD法使用的儀器為Shimadzu LC 20AT液相色譜儀，該色譜儀配制有在線真空脫氣機、二元梯度泵，自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器和LC-solution色譜工作站；色譜柱采用250mm×4.6mm，5μm的漢邦Megres C18；進樣量：20μL；流動相流速：1.2mL/min；流動相梯度：A相為甲醇-乙腈(1∶4，v∶v)，B相為0.05％甲酸，0min 35％B相，8min 20％B相，12min 20％B相，14min15％B相，16min 10％B相，20min 35％B相；柱溫：40℃；檢測波長：416nm。