[發明專利]一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法

在審

• 申請號: 201710529436.3
• 申請日: 2017-07-02
• 公開（公告）號: CN107376016A
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發明（設計）人: 沈慶春
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: A61L27/22
• 分類號: A61L27/22;A61L27/18;A61L27/50;C12N15/85;C07K14/435
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所31233
• 代理人: 黃志達,魏峯

技術領域

本發明屬于納米纖維領域，特別涉及一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法。

背景技術

蜘蛛絲是蜘蛛賴以生存的命繩，數十億年的大自然進化賦予蜘蛛絲優異的機械強度和生物學品質，綜合性能遠超蠶絲以及目前最好的人造纖維材，在現代科技生活中有著不可估量的潛在應用價值。

蛛絲肉食性，領地意識強，養殖成本高，而且蜘蛛具有同類相食的個性，無法像家蠶一樣高密度養殖。天然蜘蛛絲主要來源于結網，產量非常低。所以要從天然蜘蛛中取得蛛絲，產量非常有限。因此，通過基因工程的手段實現蜘蛛絲蛋白的原核表達就成為可行的策略了。

小口徑人造血管支架的研制與開發一直是國際上近十年來的熱點，但是到目前為止都沒有正式的產品誕生，原因在于小口徑人造血管支架的生物相容性和抗凝血的要求遠遠高于普通的大口徑人造血管支架。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，該方法反應條件溫和，成本低廉，工藝簡單，易于操作；制備出的小口徑人造血管支架具有很好的力學性能及生物相容性，厚度均勻，具有產業化實施的前景。

本發明的一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，包括：

(1)以大腹園蛛基因組為模板，通過PCR擴增得到梨狀腺絲PySp完整重復區的基因片段PySp-Rp；將PySp-Rp和pLX質粒分別進行雙酶切，純化回收后混合，再加入T4DNA連接酶反應，得到連接產物；

(2)將上述連接產物轉入DH5α感受態細胞中進行轉化，37℃過夜培養后，經酶切鑒定得到重組質粒Plx-PySp-Rp；再轉入BL21感受態細胞中，37℃過夜培養后，挑取重組質粒單克隆接入LB培養基中，37℃過夜培養后，再轉接入LB培養基中擴大培養，然后加入IPTG誘導培養，收集菌體；將菌體重懸于裂解緩沖液中，破菌后，離心、收集沉淀、純化、凍干，得到重組蛛絲蛋白PySp；

(3)將重組蛛絲蛋白PySp與PLCL混合溶于溶劑中得到紡絲液，進行靜電紡絲，最后經交聯得到重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架；其中，支架內徑在1.5～2.0mm之間，厚度在0.1～0.5mm之間。

所述步驟(1)中的PySp-Rp的序列如SEQ ID NO.1所示。基因片段PySp-Rp的基因大小為639bp，編碼213個氨基酸，蛋白分子量為22.9KDa。

所述步驟(1)中的PCR擴增所用引物為：

正向引物ATGCGGATCCGCTCCAGCACCTGCACCTAGA；

反向引物ATGCCTCGAGTTACGGTGCTGCCAGTTGAGATAG。

PCR條件為：98℃預變性3min，變性5s，65℃退火15s，72℃延伸10s，循環30次。

所述步驟(1)中的pLX質粒上具有6個His標簽，用于蛋白鑒定和純化。

所述步驟(1)中的雙酶切具體為加入內切酶BamHI和XhoI，37℃下反應1-2h進行酶切；連接酶反應的反應溫度為室溫，反應時間為12-14h。

所述步驟(2)中的連接產物和DH5α感受態細胞的體積比為1:10；重組質粒和BL21感受態細胞的體積比為1:50；BL21感受態細胞為BL21(DE3)感受態細胞。

所述步驟(2)中的LB培養基均含有濃度為100μg/ml的氨芐青霉素(即兩個LB培養基均含有氨芐青霉素)。

所述步驟(2)中的IPTG的濃度為200μg/ml；誘導培養的工藝參數為：37℃下誘導培養5h。

所述步驟(2)中的裂解緩沖液為Lysis Buffer。Lysis Buffer僅含有20mM Tris緩沖液，pH8.0。

所述步驟(2)中的破菌的壓強為1100bar；離心的轉速為12000r/min。

所述步驟(2)中的純化具體為：將沉淀用含有4M尿素的Lysis Buffer漂洗一次后，用含有8M尿素的Lysis Buffer重旋沉淀，12000rpm離心后收集上清液，透析于超純水中。

所述步驟(3)中的溶劑為六氟異丙醇，紡絲溶質的總質量濃度為8％。

所述步驟(3)中的靜電紡絲的工藝參數為：紡絲電壓14KV，給液速率0.8ml/h，紡絲距離15cm。

所述步驟(3)中的交聯采用濃度為75％的乙醇溶液。