[發(fā)明專利]一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法

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• 申請日: 2017-07-02
• 公開（公告）號: CN107376016A
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發(fā)明（設計）人: 沈慶春
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: A61L27/22
• 分類號: A61L27/22;A61L27/18;A61L27/50;C12N15/85;C07K14/435
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所31233
• 代理人: 黃志達,魏峯

1.一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，包括：

(1)以大腹園蛛基因組為模板，通過PCR擴增得到梨狀腺絲PySp完整重復區(qū)的基因片段PySp-Rp；將PySp-Rp和pLX質粒分別進行雙酶切，純化回收后混合，再加入T4DNA連接酶反應，得到連接產物；

(2)將上述連接產物轉入DH5α感受態(tài)細胞中進行轉化，37℃過夜培養(yǎng)后，經酶切鑒定得到重組質粒Plx-PySp-Rp；再轉入BL21感受態(tài)細胞中，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取重組質粒單克隆接入LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)后，再轉接入LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，然后加入IPTG誘導培養(yǎng)，收集菌體；將菌體重懸于裂解緩沖液中，破菌后，離心、收集沉淀、純化、凍干，得到重組蛛絲蛋白PySp；

(3)將重組蛛絲蛋白PySp與PLCL混合溶于溶劑中得到紡絲液，最后經交聯(lián)得到重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架；其中，支架內徑在1.5～2.0mm之間，厚度在0.1～0.5mm之間。

2.根據權利要求1所述的一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，其特征在于：所述步驟(1)中的PySp-Rp的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據權利要求1所述的一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，其特征在于：所述步驟(1)中的PCR擴增所用引物為：

正向引物ATGCGGATCCGCTCCAGCACCTGCACCTAGA；

反向引物ATGCCTCGAGTTACGGTGCTGCCAGTTGAGATAG。

4.根據權利要求1所述的一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，其特征在于：所述步驟(1)中的雙酶切具體為加入內切酶BamHI和XhoI，37℃下反應1-2h進行酶切；連接酶反應的反應溫度為室溫，反應時間為12-14h。

5.根據權利要求1所述的一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，其特征在于：所述步驟(2)中的連接產物和DH5α感受態(tài)細胞的體積比為1:10；重組質粒和BL21感受態(tài)細胞的體積比為1:50；BL21感受態(tài)細胞為BL21(DE3)感受態(tài)細胞。

6.根據權利要求1所述的一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，其特征在于：所述步驟(2)中的LB培養(yǎng)基均含有濃度為100μg/ml的氨芐青霉素。

7.根據權利要求1所述的一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，其特征在于：所述步驟(2)中的IPTG的濃度為200μg/ml；誘導培養(yǎng)的工藝參數為：37℃下誘導培養(yǎng)5h。

8.根據權利要求1所述的一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，其特征在于：所述步驟(2)中的裂解緩沖液為Lysis Buffer。

9.根據權利要求1所述的一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，其特征在于：所述步驟(3)中的溶劑為六氟異丙醇，紡絲溶質的總質量濃度為8％。

10.根據權利要求1所述的一種重組蛛絲蛋白小口徑人造血管支架的制備方法，其特征在于：所述步驟(3)中的靜電紡絲的工藝參數為：紡絲電壓14KV，給液速率0.8ml/h，紡絲距離15cm。