[發(fā)明專利]用于檢測突變體的熒光實時檢測試劑及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710527428.5
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN109207568A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發(fā)明（設計）人: 張馳宇;張夢玲
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 上海一平知識產(chǎn)權代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;馬思敏

本發(fā)明提供用于檢測突變體的熒光實時檢測試劑及方法。具體地，本發(fā)明提供了一種新的檢測突變(點突變、缺失和插入)的熒光(RT?)PCR試劑、方法和反應體系。本發(fā)明設計3’末端與模板錯配的熒光引物，利用非高保真DNA聚合酶的聚合酶活性和少量高保真DNA聚合酶的3’?5’外切酶校正功能對突變體進行檢測。本發(fā)明設計簡單，操作快捷、靈敏性強、準確度高，可廣泛用于點突變(耐藥)、單核苷酸多態(tài)性、插入和缺失突變檢測等相關的領域。

技術領域

本發(fā)明屬于核酸檢測技術領域，更具體地說，涉及用于檢測突變體的熒光實時檢測試劑、方法及其應用。

背景技術

點突變也稱作單堿基替換，指由單個堿基改變發(fā)生的突變，可以分為轉換和顛換兩類。轉換是指嘌呤和嘌呤之間的替換或嘧啶和嘧啶之間的替換；顛換是指嘌呤和嘧啶之間的替換。DNA分子中單堿基突變廣泛存在于生物體遺傳信息的編碼中，是導致遺傳性疾病的重要原因之一。在眾多導致人類疾病的基因有義突變、病原體亞型以及耐藥基因的有義突變中，大部分是單堿基突變，其檢測方法的探索一直是基因診斷研究中的重要課題，特別是對已知有義突變的檢測，將是臨床進行基因診斷的重要手段之一。

點突變、缺失和插入突變所造成的基因理化特性改變甚微，檢測非常困難。目前對單核苷酸突變位點的檢測技術主要包括：單鏈構象多態(tài)性技術、異源雙鏈分析技術、變性高效液相色譜法、變性梯度凝膠電泳等。這些傳統(tǒng)的檢測方法大多操作復雜、費時繁瑣且特異性、靈敏性及準確性較差。

因此，本領域迫切需要開發(fā)簡便、快速、靈敏、準確地檢測突變體的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是提供簡便、快速、靈敏、準確地檢測突變體的試劑及方法。

本發(fā)明的第一方面提供了一種檢測突變體的試劑，其特征在于，所述的試劑包括以下組分：

(a)第一引物，所述第一引物結構如下式I所示：

Z₁-Z₂-Z₃-F₁ (I)

式中，

F₁為熒光基團或淬滅基團；

Z₁為無或附加功能區(qū)，長度為L₁個核苷酸；

Z₂為互補結合區(qū)，長度為L₂個核苷酸；

其中，Z₁和Z₂中至少一個與F₂相連，其中F₂為熒光基團或淬滅基團；并且F₁和F₂兩者中一個為熒光基團，另一個為淬滅基團；

Z₃為3’端的位點識別區(qū)，所述識別區(qū)的長度為L₃個核苷酸，并且所述的識別區(qū)中≥60％的核苷酸與待檢測的模板檢測區(qū)序列是非匹配的，并且L₃為1-5；

(b)第二引物，所述第二引物為正常引物或與第一引物結構相同；

(c)高保真DNA聚合酶，所述高保真DNA聚合酶為具有外切活性的DNA聚合酶；和

(d)非高保真DNA聚合酶，所述非高保真DNA聚合酶不具有外切活性的DNA聚合酶。

在另一優(yōu)選例中，L1為0，或1-50個核苷酸。

在另一優(yōu)選例中，L2為10-50；較佳地12-40；更佳地15-35。

在另一優(yōu)選例中，L3為1、2、3，更佳地，1或2。