[發明專利]用于檢測突變體的熒光實時檢測試劑及方法

在審

• 申請號: 201710527428.5
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN109207568A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發明（設計）人: 張馳宇;張夢玲
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;馬思敏

1.一種檢測突變體的試劑，其特征在于，所述的試劑包括以下組分：

(a)第一引物，所述第一引物結構如下式I所示：

Z₁-Z₂-Z₃-F₁ (I)

式中，

F₁為熒光基團或淬滅基團；

Z₁為無或附加功能區，長度為L₁個核苷酸；

Z₂為互補結合區，長度為L₂個核苷酸；

其中，Z₁和Z₂中至少一個與F₂相連，其中F₂為熒光基團或淬滅基團；并且F₁和F₂兩者中一個為熒光基團，另一個為淬滅基團；

Z₃為3’端的位點識別區，所述識別區的長度為L₃個核苷酸，并且所述的識別區中≥60％的核苷酸與待檢測的模板檢測區序列是非匹配的，并且L₃為1-5；

(b)第二引物，所述第二引物為正常引物或與第一引物結構相同；

(c)高保真DNA聚合酶，所述高保真DNA聚合酶為具有外切活性的DNA聚合酶；和

(d)非高保真DNA聚合酶，所述非高保真DNA聚合酶不具有外切活性的DNA聚合酶。

2.如權利要求1所述的試劑，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶與非高保真DNA聚合酶的比例為(0.01-0.5):1，較佳地為(0.03-0.2):1；更佳地為(0.04-0.08):1。

3.如權利要求1所述的試劑，其特征在于，所述F₁為熒光基團，所述F₂為淬滅基團。

4.如權利要求1所述的試劑，其特征在于，在核酸擴增反應體系中，添加Mg²⁺終濃度為2-8mM，較佳地，3-7mM，更佳地，4mM-6mM。

5.一種核酸擴增體系，其特征在于，所述的體系包括：用于擴增的緩沖體系和位于所述體系中的權利要求1所述的試劑。

6.一種核酸擴增方法，其特征在于，所述方法包括步驟：利用如權利要求1所述的試劑、權利要求5所述的擴增體系，對待測樣品進行核酸擴增。

7.如權利要求6所述的核酸擴增方法，其特征在于，利用不同熒光和淬滅基團標記針對不同待測位點的熒光引物。

8.一種非治療性和非診斷性檢測突變體的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(a)利用如權利要求1所述的試劑、權利要求5所述的體系或權利要求6所述的核酸擴增方法，對待測樣品進行實時熒光核酸擴增；和(b)分析實時熒光核酸擴增反應擴增曲線，從而判定所述待測樣品是否存在突變。

9.一種如權利要求1所述的試劑、權利要求5所述的體系或權利要求6所述的核酸擴增方法的用途，其特征在于，用于點突變、單核苷酸多態性、插入和缺失突變的單重或多重檢測。

10.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括：(a)如權利要求1所述的試劑；(b)容器。