[發明專利]一種具有良好熱穩定性的葡萄糖氧化酶納米凝膠的制備方法

有效

• 申請號: 201710527207.8
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107164359B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 陶倩;柏良久;李桂英;薛眾鑫;王文香
• 申請（專利權）人: 魯東大學
• 主分類號: C12N11/082
• 分類號: C12N11/082;C12N11/04
• 代理公司: 煙臺上禾知識產權代理事務所(普通合伙) 37234
• 代理人: 鄭素娟

本發明涉及一種具有良好熱穩定性的葡萄糖氧化酶納米凝膠的制備方法，包括將單體、葡萄糖氧化酶和交聯劑制成混合溶液作為水相，將表面活性劑加入到不溶于水的非極性或弱極性有機溶劑中，溶解后作為油相；在攪拌條件下，將水相逐滴加入到油相中，持續攪拌，得透明穩定的微乳液體系，向微乳液體系中加入引發劑，使得單體在微乳液的水相液滴中原位地聚合和交聯，并將葡萄糖氧化酶包裹在其中，形成納米凝膠，凝膠的三維網狀結構可以對葡萄糖氧化酶實現多點、多面的固定化。即使高溫時葡萄糖氧化酶的兩個亞基間的相互作用力減弱，也不會分離。因此可以有效防止由亞基解離引起的不可逆的酶結構變化。

技術領域

本發明涉及一種納米凝膠的制備方法，尤其涉及一種葡萄糖氧化酶納米凝膠的制備方法，屬于功能高分子材料、納米材料、酶固定化技術領域。

背景技術

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase)廣泛地分布于生物體內，它能夠專一地催化葡萄糖生成葡萄糖酸以及過氧化氫，并在此過程中消耗氧氣。因而被應用于食品、飼料、醫藥等領域中，起到去除葡萄糖、脫氧、殺菌、測定葡萄糖濃度等作用。通常，葡萄糖氧化酶需要保存在低溫環境中，以保證其酶活性。但是很多涉及葡萄糖氧化酶的應用難以避免地要在較高溫度下儲存、運輸、實施，因此提高葡萄糖氧化酶的熱穩定性是一個亟待解決的技術問題，它具有重要的應用價值和大量的實際需求。

提高葡萄糖氧化酶熱穩定性的技術難點在于，它是一種具有四級結構的蛋白質。具體來說就是，葡萄糖氧化酶分子中存在兩個亞基，其在高溫環境中的變性是由亞基的解離開始的，即兩個亞基之間的相互作用力減弱，彼此逐漸分離。亞基解離會進一步引起各種結構變化，令葡萄糖氧化酶失去正確的組裝結構，從而失去活性。這造成葡萄糖氧化酶的熱失活過程比其它單亞基酶要復雜，那么提高其熱穩定性也變得更加困難。目前，提高葡萄糖氧化酶熱穩定性的方法包括介質工程、蛋白質工程、物理或化學交聯、酶固定化等。但都有一定的缺點，如操作復雜，穩定效果有限等。本發明涉及利用反相微乳液制備納米凝膠，這種方法制備過程簡便、條件溫和、被包裹在納米凝膠中的葡萄糖氧化酶的熱穩定性明顯提高。

發明內容

本發明針對現有提高葡萄糖氧化酶熱穩定性的方法存在的不足，提供一種具有良好熱穩定性的葡萄糖氧化酶納米凝膠的制備方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

一種具有良好熱穩定性的葡萄糖氧化酶納米凝膠的制備方法，包括如下步驟：

1)稱取單體、交聯劑和葡萄糖氧化酶溶解于MES緩沖溶液中制得混合溶液作為水相，其中，所述單體是指N-異丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸N,N'-二甲氨基乙酯或二者的衍生物中的任意一種；

2)將表面活性劑加入到不溶于水的非極性或弱極性有機溶劑中，溶解后作為油相；

3)在攪拌條件下，將水相逐滴加入到油相中，持續攪拌，得透明穩定的微乳液體系，控制水相與油相的體積比為1：5-1：50，且微乳液中W₀值為20；

4)向步驟3)所得的微乳液體系中加入水溶性的引發劑，引發聚合反應并進一步交聯，控制反應溫度為20-30℃，反應時間為0.5-4h,形成包裹有葡萄糖氧化酶的納米凝膠，所述引發劑包括還原組份和氧化組份，所述還原組分是指亞硫酸鹽和亞鐵鹽中的任意一種，所述氧化組分是指過硫酸鹽、過氧化氫中的一種；

5)聚合反應結束后，向反應體系中加入MES緩沖溶液，打破反應體系中的油水平衡，冷藏靜置，待油水界面清晰后去除油相，將水相轉移進透析袋中，將透析袋中的產品至于MES緩沖溶液中透析48h以上，以去除表面活性劑和殘余單體，即得葡萄糖氧化酶納米凝膠；

其中，所述MES緩沖溶液是指2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液。