[發明專利]一種高存活率的細胞復蘇方法

在審

• 申請號: 201710527030.1
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107217031A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 王文峰;曹先艷;馬瑩
• 申請（專利權）人: 太倉東潯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙)32267
• 代理人: 馬廣旭

技術領域

本發明屬于生物技術應用領域，具體地，涉及一種高存活率的細胞復蘇方法。

背景技術

細胞培養是生物與健康相關研究領域的一項重要技術。隨著生命科學的迅速發展，目前細胞培養已成為細胞生物學、分子生物學、遺傳學和免疫學等學科研究的重要基礎。為了深入探討細胞的生長活動規律、有關疾病的病理和藥物的藥理（毒理）機制，開發具有不同針對性的細胞培養方法具有重要意義。

細胞復蘇是培養細胞的一種，是生命及再生醫學領域中廣泛應用的關鍵技術，在研究中往往需要對凍存的細胞進行復蘇。尤其隨著細胞治療個性化技術的興起，體外擴增特殊功效的細胞成了臨床前研究以及臨床治療的重點研發項目。具有體外擴增特殊功效的細胞包括由多功能的造血干細胞、T細胞、NK細胞、DC細胞以及CIK細胞等，將這類細胞體外擴增之后再回輸到哺乳生物體內，有利于提高機體的造血裝置功能：如提升紅細胞、免疫細胞等的數量及功能維護、抗腫瘤能力以及免疫防御能力。

發明內容

發明目的：本發明提供了一種高存活率的細胞復蘇方法，用于多種人源以及非人源細胞的培養。

技術方案：本發明提供了一種高存活率的細胞復蘇方法，包括以下步驟：將凍存的細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內于37℃搖晃至含有細胞凍存液的細胞液完全融化，將細胞液加入到盛有2-3ml新鮮培養基的離心管中，用移液槍上下吹打20-30次，于1000-1500g/min的轉速下離心3-10min；移去上清液，加入1-2ml的新鮮培養基，用移液槍上下吹打40-50次，然后均勻的加入到盛有7-9ml的新鮮培養基的細胞培養皿中，于37℃，5%CO₂培養箱中培養。本發明所述的高存活率的細胞復蘇的方法，其方法合理，應用便捷，復蘇后的細胞存活率高，活性好，可以穩定用于生物與健康相關研究。

進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述培養基包括70-90%的基礎培養基以及10-30%的胎牛血清。培養基組分合理，營養豐富，可以為細胞培養提供更多的營養物（包括生長因子等），細胞生長速度快，細胞狀態好。

進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述細胞凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5-15份、羥乙基淀粉2-5份、殼聚糖5-10份、谷胱甘肽2-5份、維生素C1-4份、右旋糖酐0.3-4份、丙二醇0.5-2份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1-1份和基礎培養基80-90份。凍存液組分合理，營養豐富，其中右旋糖酐為滲透性保護液，而N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺則抑制細胞活動和基因表達，維生素C的抗氧化性好，在保證休眠細胞的營養的同時還可以顯著減少對細胞的損傷，提高凍存細胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的狀態。

進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖 82-88份、碳酸氫鈉12-25份、丙酮酸鈉10-16份、絲膠蛋白5-9份、氯化鉀35-45份、無水硫酸鎂 6-10份、氯化鈉70-78份、無水磷酸二氫鈉10-14份、葉酸 0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、煙酰胺0.3-0.6份、無水氯化鈣25-35份、硝酸鐵0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸鈉12-16份、D-泛酸鈣 0.3-0.6份、酒石酸膽堿0.6-0.8份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.2-0.4份、鹽酸吡哆辛 0.3-0.5份、N-異丙基丙烯酰胺0.2-0.4份、亞麻酸1-2份、乙醇胺0.6-0.8份、芳香酸酯0.3-0.8份、酚紅鈉1-1.3份和去離子水100份。

進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述基礎培養基還包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：L-鹽酸精氨酸 5-10份、L-鹽酸胱氨酸 3-8份、L-絲氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、L-鹽酸組氨酸 4-6份、L-異亮氨酸8-20份、L-亮氨酸7-18份、L-鹽酸賴氨酸10-20份、L-甲硫氨酸1-6份、L-苯丙氨酸2-8份、L-蘇氨酸5-15份、L-色氨酸1-3份、L-酪氨酸5-9份和L-纈氨酸8-12份。

進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述基礎培養基還包括2-5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細胞生長因子2-10份、白介素2 3-8份、白介素4 3-6份、白介素14 1-5份、IFN-γ3-6份和神經白細胞素1-4份。