[發明專利]一種簡便的病毒體外三維培養模型的建立方法在審

申請號：	201710525731.1	申請日：	2017-06-30
公開（公告）號：	CN107164300A	公開（公告）日：	2017-09-15
發明（設計）人：	朱智杰	申請（專利權）人：	蘇州誠晟信息技術有限公司
主分類號：	C12N5/00	分類號：	C12N5/00
代理公司：	蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙)32267	代理人：	馬廣旭
地址：	215400 江蘇省***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種簡便病毒體外三維培養模型建立方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種病毒培養用的體外模型，具體地，涉及一種簡便的病毒體外三維培養模型的建立方法。

背景技術

在病毒學的發展史中，常利用易感動物如家兔、小白鼠、豚鼠等對目的病毒進行實驗。動物模型可以觀察病毒對機體的侵害，造成病理變化的部位，但動物個體差異大，價格昂貴，還需要特殊的動物房，因此推廣起來成本巨大。隨著科學的發展，也出現了很多體外培養病毒的模型，但常規的細胞培養技術模型往往并不能反應病毒在體內的致病過程。

發明內容

發明目的：為了克服以上不足，本發明提供了一種簡便的病毒體外三維培養模型的建立方法，運用三維培養技術，既能避免動物體內實驗帶來的高成本，又能最大程度的模擬動物體內生長模式，使所培養的細胞呈現立體生長方式，形成類似體內的組織結構，進而有助于模擬病毒體內的致病過程，該模型方法簡便，成本低廉，推廣方便。

技術方案：為了克服現有技術中存在的不足，本發明提供了一種簡便的病毒體外三維培養模型的建立方法，包括以下操作步驟：

（1）微載體混懸液的準備：稱取1-3份的微載體，置于玻璃容器內，按照微載體1份：50ml磷酸鹽緩沖液的比例加入磷酸鹽緩沖液，混勻1-3h，然后再用新鮮的清洗液洗滌2-3次，再按照微載體1份：50ml磷酸鹽緩沖液的比例加入新鮮的磷酸鹽緩沖液，高壓滅菌，冷卻后4℃保存；

（2）細胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細胞貼壁阻滯劑粉末，加入無水乙醇，密封后混勻10-30分鐘，4℃保存；

（3）準備6孔板，將制備好的細胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風干，再將制備好的細胞以10⁵/ml的濃度接種于6孔板中，所述細胞培養基包括70-90%的基礎培養基以及10-30%的胎牛血清，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖 82-88份、碳酸氫鈉 12-25份、丙酮酸鈉10-16份、人血白蛋白5-9份、氯化鉀35-45份、無水硫酸鎂 6-10份、氯化鈉70-78份、無水磷酸二氫鈉10-14份、PHA-植物血球凝集素0.4-0.8份、葉酸 0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、煙酰胺0.3-0.6份、無水氯化鈣25-35份、硝酸鐵0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸鈉12-16份、D-泛酸鈣 0.3-0.6份、酒石酸膽堿0.6-0.8份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.2-0.4份、鹽酸吡哆辛 0.3-0.5份、還原谷胱甘肽 0.2-0.6份、膽固醇2-4份、抗壞血酸磷酸酯0.6-1份、聚碳酸酯0.4-0.9份、酚紅鈉1-1.3份和去離子水100份；再加入制備好的微載體混懸液，細胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細胞培養箱內，3-4天等細胞三維結構成型后，即可進行病毒接種實驗。

該模型的建立既能避免動物體內實驗帶來的高成本，又能最大程度的模擬動物體內生長模式，使所培養的細胞呈現立體生長方式，形成類似體內的組織結構，進而有助于模擬病毒體內的致病過程，該模型方法簡便，成本低廉，推廣方便。

進一步的，上述的一種簡便的病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述微載體為Cytodex3。與Cytodex1/2相比，該種微載體實用性更廣，適合更多類型的細胞接種，便于多種疾病模型的建立。

進一步的，上述的一種簡便的病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述細胞貼壁阻滯劑為poly-hema。該阻滯劑可以有效的阻止細胞貼附在培養板底部，進而促進三維培養模型的順利建立。

進一步的，上述的一種簡便的病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述高壓滅菌時的溫度為120℃-140℃，滅菌時間30-50分鐘。

進一步的，上述的一種簡便的病毒體外三維培養模型的建立方法，所述清洗液包括如下組份：按重量組份計，

氯化鈉：50-80份

氯化鉀：2-5份

磷酸氫二鈉：10-15份

磷酸二氫鉀：1-5份

氯化鎂：8-10份

葡萄糖：5-10份

去離子水：40-50份。