[發(fā)明專利]一種慢性乙肝治療性DC疫苗

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710524296.0
• 申請(qǐng)日: 2017-06-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107335054B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉明錄;王立新;馮建海;姜夕鋒;萬(wàn)磊;張傳鵬;強(qiáng)邦明;金海鋒;韓慶梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/29
• 分類號(hào): A61K39/29;A61P31/20;A61P1/16;C12N15/86;C12N15/62;C12N5/10;C12N5/0784
• 代理公司: 山東華君知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37300
• 代理人: 武歡歡

本發(fā)明公開(kāi)了一種慢性乙肝治療性DC疫苗，包括經(jīng)基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞，所述經(jīng)基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞中含有粒細(xì)胞?巨噬細(xì)胞簇因子受體信號(hào)肽引導(dǎo)編碼M?HBsAg的preS2區(qū)域和S區(qū)域的融合基因片段，該發(fā)明能夠免疫機(jī)體時(shí)就可以產(chǎn)生針對(duì)pres2抗原的特性抗體，這些抗體具有良好的中和HBV病毒的作用，從而保護(hù)宿主免受HBV病毒的感染，可以誘導(dǎo)HBsAg?HBsAb的血清學(xué)轉(zhuǎn)化，降低肝內(nèi)的乙肝病毒感染，增強(qiáng)免疫效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，是一種慢性乙肝治療性DC疫苗。

背景技術(shù)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)，全球流行最廣的嗜肝病毒，感染后可引起急、慢性和重型肝炎，并與肝硬化、肝癌的發(fā)病密切相關(guān)。在我國(guó)，HBV攜帶者約9300萬(wàn)人，其中慢性乙肝患者高達(dá)2500萬(wàn)，是我國(guó)最為嚴(yán)重的三大傳染病之一。目前臨床上對(duì)慢性乙肝患者的主要治療藥物包括核苷(酸)類似物、干擾素和免疫調(diào)節(jié)劑，這些藥物均不能徹底清除乙肝病毒，并且復(fù)發(fā)率高。因此，研發(fā)有效的治療策略顯得極為迫切。

如何誘導(dǎo)強(qiáng)有力的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，打破體內(nèi)HBV特異性T細(xì)胞免疫耐受已經(jīng)成為目前的主要研究方向。由于DC疫苗在誘導(dǎo)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已作為針對(duì)慢性乙肝具有潛力的免疫治療手段被廣泛研究。目前慢性乙肝DC疫苗研究的焦點(diǎn)：(1)如何獲得有效的HBV抗原(抗原必須在慢性乙肝中不耐受)。(2)如何進(jìn)一步增強(qiáng)DC疫苗的免疫效應(yīng)。

HBV表面蛋白質(zhì)或抗原(HbsAg)是由preS(preS1和preS2)區(qū)域及S區(qū)域的基因通過(guò)三種起始密碼子各自進(jìn)行交替翻譯編碼的三種包膜蛋白(L蛋白，M蛋白和S蛋白)。S-HbsAg由226個(gè)氨基酸組成，僅包括S區(qū)域，是慢性乙型肝炎患者血清中假病毒顆粒的主要成分，也是目前臨床預(yù)防性乙肝疫苗的成分；M-HBsAg是由281個(gè)氨基酸組成，包括S和preS2區(qū)域，也是假病毒顆粒的重要組成成分；L-HBsAg是約400個(gè)氨基酸組成(根據(jù)乙肝不同亞型，ay型389個(gè)，ad型400個(gè))，包括preS1域，preS2域及S域。目前研究表明：慢性HBV感染過(guò)程中，不同的病毒抗原存在不同的耐受狀態(tài)。S區(qū)域存在著很強(qiáng)的免疫耐受狀態(tài)，直接以此作為疫苗，無(wú)法在HBV耐受小鼠中產(chǎn)生治療性效果。

發(fā)明內(nèi)容

為了彌補(bǔ)以上不足，但是以preS1區(qū)域作為疫苗就能夠在HBV耐受模型體內(nèi)引起細(xì)胞免疫反應(yīng)。并且聯(lián)合preS1疫苗和HBsAg疫苗，可以誘導(dǎo)HBsAg-HBsAb的血清學(xué)轉(zhuǎn)化，降低肝內(nèi)的乙肝病毒感染。由此可知，同時(shí)含有preS1抗原和S抗原的疫苗與只含有S抗原的疫苗相比免疫原性更強(qiáng)。由此本發(fā)明提供一種慢性乙肝治療性DC疫苗

本發(fā)明的方案是：

一種慢性乙肝治療性DC疫苗，包括經(jīng)基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞，所述經(jīng)基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞中含有粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞簇因子受體信號(hào)肽引導(dǎo)編碼M-HBsAg的preS2區(qū)域和S區(qū)域的融合基因片段。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞簇因子受體信號(hào)肽為序列表SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述M-HBsAg為序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種將樹(shù)突狀細(xì)胞負(fù)載融合基因片段的方法：將所述粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞簇因子受體信號(hào)肽引導(dǎo)編碼M-HBsAg的preS2區(qū)域和S區(qū)域的基因片段緩慢插入慢病毒表達(dá)載體pLent-C-GFP中，包裝成攜帶GM-CSFR SP-M-HBsAg編碼基因的慢病毒，同時(shí)，將慢性乙型肝炎患者的體外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)成imDC，將攜帶GM-CSFR SP-M-HBsAg編碼基因的慢病毒感染所述imDC，并將感染后的imDC經(jīng)成熟因子誘導(dǎo)，得到成熟DC疫苗。