[發明專利]一種慢性乙肝治療性DC疫苗

有效

• 申請號: 201710524296.0
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107335054B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 劉明錄;王立新;馮建海;姜夕鋒;萬磊;張傳鵬;強邦明;金海鋒;韓慶梅
• 申請（專利權）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/29
• 分類號: A61K39/29;A61P31/20;A61P1/16;C12N15/86;C12N15/62;C12N5/10;C12N5/0784
• 代理公司: 山東華君知識產權代理有限公司 37300
• 代理人: 武歡歡

1.一種慢性乙肝治療性DC疫苗，其特征在于：包括經基因修飾的樹突狀細胞，所述經基因修飾的樹突狀細胞中含有粒細胞-巨噬細胞簇因子受體信號肽引導編碼M-HBsAg的融合基因片段GM- CSFR SP-M-HBsAg；

所述融合基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述粒細胞-巨噬細胞簇因子受體信號肽的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

所述DC疫苗的制備方法，包括將樹突狀細胞負載融合基因片段的方法：將所述融合基因片段緩慢插入慢病毒表達載體pLent-C-GFP中，包裝成攜帶GM- CSFR SP-M-HBsAg編碼基因的慢病毒，同時，將慢性乙型肝炎患者的體外周血單個核細胞誘導成imDC，將攜帶GM-CSFR SP-M-HBsAg編碼基因的慢病毒感染所述imDC，并將感染后的imDC經成熟因子誘導，得到成熟DC疫苗；所述M-HBsAg的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

2.如權利要求1所述的一種慢性乙肝治療性DC疫苗，其特征在于，所述DC疫苗的制備方法，還包括將所述慢性乙型肝炎患者的體外周血單個核細胞誘導成imDC的方法：采集慢性乙型肝炎病人外周靜脈血 50ml，利用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，在培養基中，37℃，5％的CO₂條件下培養2-3小時后，倒掉懸浮T細胞，留取貼壁細胞，并加入細胞因子rhIL-4、rhGM-GSF，誘導單個核細胞分化成DC，每隔48小時更換新培養基，培養第5天得到imDC。

3.如權利要求1所述的一種慢性乙肝治療性DC疫苗，其特征在于：所述成熟因子為成熟因子TNF-α。

4.如權利要求1所述的一種慢性乙肝治療性DC疫苗，其特征在于，所述DC疫苗的制備方法，還包括將所述融合基因片段包裝成攜帶 GM-CSFR SP-M-HBsAg編碼基因的慢病毒的方法：將慢病毒包裝細胞系293T接種于含有DMEM +10％FBS 的10cm培養皿中，37℃，5％的CO₂條件下培養，貼壁率為70％-80％后進行轉染；慢病毒包裝質粒和包含融合基因片段的慢病毒表達載體pLent-C-GFP采用磷酸鈣轉染法共轉染293T細胞；轉染24h后，細胞明顯增大、呈球形，細胞核變大、變圓，貼壁能力下降而易脫落；48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞內有綠色熒光蛋白表達；72h后，收集上清，過濾除菌，得到重組GM-CSFR SP-M-HBsAg 慢病毒，所述重組GM-CSFR SP-M-HBsAg慢病毒在-80℃低溫冰箱中保存備用。