[發明專利]包含內部標記引物的核酸的測序、擴增和檢測方法

在審

• 申請號: 201710523381.5
• 申請日: 2012-05-04
• 公開（公告）號: CN107190078A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 弗蘭切斯卡·迪帕斯奎爾;丹尼爾·米勒
• 申請（專利權）人: 凱杰有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司11219
• 代理人: 楊青,穆德駿

本申請為國際申請日2012年5月4日、國際申請號PCT/EP2012/058259于2013年11月6日進入中國國家階段、申請號201280022096.0、發明名稱“包含內部標記引物的核酸的測序、擴增和檢測方法”的分案申請。

技術領域

本發明屬于生物學和化學領域，特別是分子生物學領域。更具體來說，本發明涉及用于核酸測序或擴增和檢測的方法和試劑盒。

背景技術

如今，分子方法在診斷學和鑒定個體，例如在法醫學領域或親子鑒定中發揮重要作用。靶區域的擴增是這些方法中的中心程序。此外，方法包括在大多數情況下通過凝膠電泳如毛細管電泳來分析被擴增靶區域的長度。被擴增材料的分析通過熒光標記物的檢測來進行。將標記物附連到用于擴增的位點特異性引物的5’-末端。然而，當分析擴增產物時，小的干擾性人為峰、即所謂的“染料污跡(dye blobs)”的出現，導致基線具有高的“背景噪音”，這干擾了方法的靈敏度。“染料污跡”是電泳圖中不代表特異性擴增產物，而是代表包含標記物的降解產物的峰。造成它們的分子是游離的熒光染料標記物以及與標記物相連的1-8bp長的寡核苷酸。后者可能代表降解的引物或降解的PCR產物。

現在，本發明人出人意料地發現，內部標記的寡核苷酸引物的使用減少了染料污跡的出現。因此，本申請提供了用于測序或擴增和檢測核酸的方法，所述方法包括使用內部標記的核酸引物。使用內部標記的引物的技術效果是提供了具有更高靈敏度的方法。

發明內容

因此，本發明解決了上面提到的問題，并提供了用于測序或擴增和檢測核酸的方法，所述方法包括下列步驟：

i)提供至少一種核酸引物，其包含至少一個標記的核苷酸，

ii)提供酶和試劑，其使用所述至少一種標記的核酸引物來擴增靶核酸，

iii)將反應組分在適合于靶核酸引物的擴增的條件下溫育，

iv)通過標記的核苷酸來檢測擴增的核酸，

其中所述核酸引物包含下列序列：

5’-N_aXN_b-3’，

其中N可以是任意核苷酸或修飾的核苷酸，

其中a和b表示核苷酸數量，并可以在1至150的范圍內；

并且其中X是所述至少一個標記的核苷酸。

在本文中，“核酸引物”是指適用于擴增的寡核苷酸。本領域技術人員應該理解，為了適用于擴增，3’-末端應該可以通過聚合酶進行延伸。核酸引物可以使用任何適合的方法來制備，例如磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自動化實施方式。在一種這樣的自動化實施方式中，使用二乙基-亞磷酰胺作為起始原料，其可以如Beaucage等，Tetrahedron Letters,22:1859-1862(1981)所述進行合成，該文獻通過引用并入本文。一種在修飾的固體支持物上合成寡核苷酸的方法描述在美國專利號4,458,006中，所述專利通過引用并入本文。還可以使用從生物樣品(例如限制性內切酶消化物)分離的引物。核酸引物的長度可以各不相同。長度可以適應于需要。

在本發明的方法的情形中，“核酸”是指樣品中特定類型的核酸，尤其是RNA、DNA、cDNA(互補DNA)、LNA(鎖核酸)、mRNA(信使RNA)、mtRNA(線粒體的)、rRNA(核糖體RNA)、tRNA(轉運RNA)、nRNA(核RNA)、siRNA(短干擾RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(小核仁RNA)、scaRNA(小卡哈爾體特異性RNA)、microRNA、dsRNA(雙鏈RNA)、核酶、核糖開關、病毒RNA、dsDNA(雙鏈DNA)、ssDNA(單鏈DNA)、質粒DNA、粘粒DNA、染色體DNA、病毒DNA、mtDNA(線粒體DNA)、nDNA(核DNA)、或snDNA(小核DNA)等，或可以與樣品中主體核酸區分開的任何其他類型或亞類的核酸。