[發明專利]一種重組α-半乳糖苷酶基因、載體、工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201710522450.0
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107164398B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 朱廷恒;潘艷青;潘籽龍;孫徽;汪琨;王渭霞
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/40;C12N1/19;C12P17/10;C12R1/865
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種重組α?半乳糖苷酶基因、載體、工程菌及其應用，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。釀酒酵母是食品安全菌，構建的重組α?半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌產α?半乳糖苷酶，可以進行豆類、糖蜜的發酵加工，可以去除發酵原料中的抗營養因子不良寡糖，提高食品、飼料的營養價值和消化吸收率，提高資源的利用率。釀酒酵母中轉入的α?半乳糖苷酶源于嗜熱真菌米赫根毛霉(R.miehei)，有一定的熱穩定性。本發明的工程菌產生的重組α?半乳糖苷酶則有一定的熱穩定性，其最適溫度在60℃，在60℃水浴80min后還可以保持80％的活性。

(一)技術領域

本發明涉及一種重組α-半乳糖苷酶基因、載體、工程菌及其應用，該菌株或產生的酶可以應用于飼料、食品中的抗營養因子的降解，應用于造紙工業中的紙漿預處理、臨床醫療中的器官移植或血型改造等。

(二)背景技術

大豆是重要的食品原料，可以加工成豆奶等營養豐富的食品。豆粕是大豆工業的主要固態副產物，是我國非常重要的飼料原料之一。但是，大豆中含有大量的難以消化的不良寡糖，如棉子糖、水蘇糖等α-半乳寡糖。這些不良寡糖是抗營養因子，不能很好地被人或動物吸收利用，而在腸道中經過厭氧發酵產生大量氣體，引起腹脹、腹瀉、胃腸痛等現象。

甘蔗糖蜜是蔗糖生產過程的副產物，其中含有大量的糖分，常被用作工業微生物發酵的培養基碳源。利用糖蜜發酵生產有用的物質不僅可以解決蔗糖生產污染環境問題，而且能夠實現資源化利用，具有重要的意義。但是，甘蔗糖蜜還含有一部分不能被釀酒酵母等食品級生物安全微生物利用的糖分，主要由蜜二糖、棉子糖、水蘇糖等構成，通常占甘蔗糖蜜總重量的5％。

α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)，是一種可以催化α-半乳糖苷鍵的水解的外切水解酶，催化移除不同底物中α-連接的末端非還原D-半乳糖，水解棉籽糖、水蘇糖、半乳甘露聚糖及半乳糖脂等。因此，該酶可以消除豆粕、糖蜜中的棉籽糖和水蘇糖等抗營養因子，可以作為添加劑應用于食品、飼料工業，提高食品或飼料的消化吸收率和營養價值。

此外，α-半乳糖苷酶還可以用在醫療、造紙業中。細胞溶酶體內α-半乳糖苷酶酶活降低可以引起一種的罕見的遺傳性疾病Fabry病。目前，對該病進行α-半乳糖苷酶替代療法療效可以得到增強。α-半乳糖苷酶還可以用來水解抗原、改造血型，從而降低異種器官移植、輸血過程中的免疫排斥反應。而在造紙工業中，α-半乳糖苷酶可以水解軟木中的半纖維成分半乳葡聚甘露聚糖，分離出其中的α-半乳糖，對紙漿預處理有一定的作用。

α-半乳糖苷酶在植物(水稻、豆芽、咖啡豆、葡萄等)、細菌(鏈霉菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、雙歧桿菌和巨大芽孢桿菌)中、真菌(根霉、青霉、黑曲霉、米曲霉)等生物中存在。但是，在釀酒酵母、乳酸菌等常用的食品安全級的微生物中，酶活很低，甚至沒有該酶。因此，將其他生物來源的α-半乳糖苷酶基因克隆，利用基因工程技術轉入酵母菌等，然后進行食品、豆粕的發酵加工，不僅可以去除不良寡糖抗營養因子，還可以提高益生菌的數量，提高食品、飼料品質。此外，轉α-半乳糖苷酶基因的酵母菌在培養的時候，可以充分利用糖蜜中的難發酵糖，提高資源利用率。雖有將α-半乳糖苷酶轉入畢赤酵母的報道(CN105219791A)，但是畢赤酵母不是飼料、食品等加工的生物安全菌(見《飼料添加劑品種目錄(2013)》)，而釀酒酵母是啤酒發酵、釀造、豆粕類加工的可食用生物安全菌。此外，普通的α-半乳糖苷酶熱穩定性差，不便于食品、飼料加工。因此，需要構建轉α-半乳糖苷酶基因的釀酒酵母，還需要克隆熱穩定性好、耐高溫的α-半乳糖苷酶基因并轉入釀酒酵母。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種重組α-半乳糖苷酶基因及其重組基因工程菌釀酒酵母，該工程菌可以產生α-半乳糖苷酶并應用于食品、飼料加工、生產α-半乳糖苷酶等，可以去除不良寡糖等抗營養因子。釀酒酵母被用于豆類食品加工、豆粕飼料加工等，但是釀酒酵母幾乎沒有α-半乳糖苷酶活性，不能去除豆類中的不良寡糖。本發明構建的重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌具有α-半乳糖苷酶活性，可以去除不良寡糖。

本發明采用的技術方案是：