[發明專利]用于測定生物材料中目標序列甲基化率的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201710522272.1
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN109207618B
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 謝家建;彭于發
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 向群

本發明“用于測定待測生物材料中目標序列甲基化率的方法”，屬于生物技術領域。所述方法包括：(1)用內切酶酶切處理所述待測生物材料的基因組DNA；(2)用目標序列的特異性引物對步驟(1)所得到的酶切產物進行熒光定量PCR擴增，獲得酶切后的待測生物材料目標序列的Ct值：Ct_m；(3)用所述目標序列的特異性引物對未經所述內切酶酶切的待測轉基因植物的基因組DNA進行熒光定量PCR擴增，獲得對照處理的所述待測生物材料目標序列的Ct值：Ct_k；(4)計算待測生物材料的目標序列甲基化率：M；M＝2^?ΔCtm；其中，ΔCt_m＝Ct_m?Ct_k本發明為測定轉基因棉花中CaMV35S啟動子的甲基化率提供了便利，具有快速簡便、靈敏度高、所需實驗條件不高，有非常高的實用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別是涉及一種用于測定生物材料中目標序列甲基化率的方法及試劑盒。

背景技術

DNA甲基化是真核生物表觀遺傳學重要的機制之一，在基因的表達調控中發揮著重要的作用。DNA甲基化是真核生物基因組進行局部調整的主要方式，如基因組序列中腺嘌呤的N-6位、鳥嘌呤的N-7位和胞嘧啶的N-4位以及胞嘧啶的C-5位均可能發生甲基化，其中胞嘧啶的C-5位是最常見的甲基化位點，已成為當前該領域研究的熱點問題。現有研究表明，DNA甲基化參與了生物體中多種代謝與生理生化過程，如基因的時空特異性表達(包括基因沉默)、自交不親和、X染色體失活、衰老以及癌癥的發生及物種進化等。

CaMV35S啟動子是指來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子。它是轉基因植物中使用頻率最高的啟動子，能在許多植物物種，幾乎所有發育階段及所有組織中高效表達，被廣泛用于構建轉基因植株，如玉米、棉花、大豆、番茄等。轉基因沉默是轉基因植物中經常被發現的現象，有研究表明，在轉基因沉默的棉花植株中，CaMV35S啟動子的甲基化是造成標記基因沉默的主要原因。因此測定轉基因植物中CaMV35S啟動子的甲基化是分析轉基因植物是否可能發生轉基因沉默的重要內容之一。

在過去數十年中，DNA甲基化的分析方法得到了長足的發展，人們已建立了多種檢測DNA甲基化的方法與技術。針對基因組DNA特定序列，目前，DNA甲基化分析技術主要分為以下兩類：第一類是依托各種測序技術，針對特定序列進行DNA甲基化位點檢測與分析；第二類是依托PCR技術的甲基化分析技術。由于PCR技術的普遍性與快速方便等特點，因此，目前DNA甲基化分析檢測方法以第二類應用最為廣泛。目前常用的DNA甲基化分析是采用亞硫酸鹽處理基因組DNA，再通過PCR擴增目的區域，克隆測序。通過序列比對來分析目標區域的甲基化情況。這種方法盡管獲得的甲基化信息比較全面，但操作步驟多，耗時也較長，由于要進行多個克隆的測序，成本也很高。

發明內容

本發明基于本領域存在的上述缺陷，提供了一種利用熒光定量PCR快速測定待測生物材料中目標序列甲基化率的方法，尤其是測定轉基因植物中CaMV35S啟動子甲基化率的試劑盒及方法。采用本發明的試劑盒及方法，可快速、準確地定量檢測出待測生物材料中目標序列的甲基化程度，更能準確測定出轉基因植物中CaMV35S啟動子甲基化率，從而進一步獲知目標轉基因植物中是否存在因啟動子甲基化導致的可能的基因沉默。

本發明的技術方案如下：

本發明第一個方面提供一種用于測定待測生物材料中目標序列甲基化率的方法，其特征在于，包括：

(1)用內切酶酶切處理所述待測生物材料的基因組DNA；

所述內切酶對CpG甲基化敏感，且所述目標序列上分布有所述內切酶的切割位點序列；

經所述酶切處理后得到的酶切產物為包含有酶切后的目標序列的待測生物材料的基因組DNA；