[發明專利]用于測定生物材料中目標序列甲基化率的方法及試劑盒有效
| 申請號： | 201710522272.1 | 申請日： | 2017-06-30 |
| 公開（公告）號： | CN109207618B | 公開（公告）日： | 2020-05-29 |
| 發明（設計）人： | 謝家建;彭于發 | 申請（專利權）人： | 中國農業科學院植物保護研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129 | 代理人： | 向群 |
| 地址： | 100193 *** | 國省代碼： | 北京;11 |
| 權利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 用于 測定 生物 材料 目標 序列 甲基化 方法 試劑盒 | ||
1.用于測定轉基因植物中CaMV35S啟動子序列甲基化率的方法，其特征在于，采用測定待測生物材料中目標序列甲基化率的方法，用內切酶酶切處理待測轉基因植物的基因組DNA，并CaMV35S啟動子序列的特異性引物對酶切后的待測轉基因植物的基因組DNA進行熒光定量PCR，獲得酶切后的待測轉基因植物的CaMV35S啟動子序列的Ct值：Ctm35S；
用所述CaMV35S啟動子序列的特異性引物對未經酶切的待測轉基因植物的基因組DNA進行熒光定量PCR獲得對照處理的所述轉基因植物CaMV35S啟動子的Ct值：Ctk35S；
計算待測轉基因植物的CaMV35S啟動子序列甲基化率：M35S；
M35S= 2-ΔCtm；其中，ΔCtm = Ctm35S- Ctk35S；
所述CaMV35S啟動子特異性引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述內切酶為
所述測定待測生物材料中目標序列甲基化率的方法包括：
（1）用內切酶酶切處理所述待測生物材料的基因組DNA；
所述內切酶對CpG甲基化敏感，且所述目標序列上分布有所述內切酶的切割位點序列；
經所述酶切處理后得到的酶切產物為包含有酶切后的目標序列的待測生物材料的基因組DNA；
（2）用目標序列的特異性引物對步驟（1）所得到的酶切產物進行熒光定量PCR擴增，獲得酶切后的待測生物材料目標序列的Ct值：Ctm；
所述目標序列的特異性引物基于含有所述內切酶切割位點序列的目標序列設計而得，且其上下游引物之間的擴增片段區域覆蓋所述內切酶切割位點序列；
（3）用所述目標序列的特異性引物對未經所述內切酶酶切的待測轉基因植物的基因組DNA進行熒光定量PCR擴增，獲得對照處理的所述待測生物材料目標序列的Ct值：Ctk；
（4）計算待測生物材料的目標序列甲基化率：M；
M= 2-ΔCtm；其中，ΔCtm = Ctm- Ctk。
2.根據權利要求1所述的用于測定轉基因植物中CaMV35S啟動子序列甲基化率的方法，其特征在于，所述測定待測生物材料中目標序列甲基化率的方法還包括：用內參基因校準；
采用所述內參基因的特異性引物分別對步驟（1）所得到的酶切產物，和未經所述內切酶酶切的待測生物材料的基因組DNA，分別進行熒光定量PCR擴增，分別得到酶切處理的內參基因的Ct值：Ctmnc，和對照處理的內參基因的Ct值：Ctknc；
所述內參基因特異性引物的擴增片段區域不包含所述內切酶的切割位點序列；
所述待測生物材料目標序列甲基化率：M= 2-ΔΔCt；其中，ΔΔCt=ΔCtm -ΔCtk；ΔCtk=Ctmnc- Ctknc。
3.根據權利要求1所述的用于測定轉基因植物中CaMV35S啟動子序列甲基化率的方法，其特征在于，所述步驟（2）和步驟（3）中的PCR擴增為同時進行，且進行熒光定量PCR擴增時的模板DNA用量一致。
4.根據權利要求2所述的用于測定轉基因植物中CaMV35S啟動子序列甲基化率的方法，其特征在于，所述內參基因選自待測生物材料領域的公知內參基因。
5.根據權利要求1-4任一所述的用于測定轉基因植物中CaMV35S啟動子序列甲基化率的方法，其特征在于，所述待測生物材料為轉基因植物材料。
6.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述目標序列選自DNA序列。
該專利技術資料僅供研究查看技術是否侵權等信息，商用須獲得專利權人授權。該專利全部權利屬于中國農業科學院植物保護研究所，未經中國農業科學院植物保護研究所許可，擅自商用是侵權行為。如果您想購買此專利、獲得商業授權和技術合作，請聯系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201710522272.1/1.html，轉載請聲明來源鉆瓜專利網。
