[發(fā)明專利]一種改良的定量檢測海水青鳉魚卵黃原蛋白的試劑盒、制備方法及應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107367617A
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宮玉峰;易先亮;鐘熙;張紹帥
• 申請（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/74;G01N33/531
• 代理公司: 大連理工大學(xué)專利中心21200
• 代理人: 李曉亮,潘迅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，涉及一種改良的定量檢測海水青鳉魚卵黃原蛋白的試劑盒，具有更佳的檢測重復(fù)性和精確度，適于海洋環(huán)境雌激素污染的生物監(jiān)測。

背景技術(shù)

環(huán)境雌激素是一類種類多樣的外源化合物，能夠擾亂生物體正常的激素水平，損害內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，并進一步影響野生動物的繁殖過程、種群性別比例及規(guī)模。近年來，海洋環(huán)境雌激素污染問題引起了越來越多的關(guān)注。

卵黃原蛋白(Vitellogenin,Vtg)是卵生動物卵黃蛋白的前體，在17β-雌二醇的刺激下，由肝臟合成與分泌，通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)運至卵巢，作為胚胎發(fā)育的營養(yǎng)源。通常情況下，Vtg由卵黃生成期的雌魚大量合成，而雄魚與幼魚因內(nèi)源雌激素水平較低而不能合成或合成量很低。但雄魚與幼魚同樣具有Vtg基因，在外源雌激素的作用下，也可被誘導(dǎo)合成Vtg。因此，雄魚或幼魚的Vtg水平是指示環(huán)境雌激素污染的理想指標(biāo)。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)因具有檢測靈敏度高、操作簡便、快速的優(yōu)點，已被廣泛用于Vtg的檢測。目前，已建立Vtg ELISA檢測方法的魚類多為淡水魚，包括斑馬魚(Danio rerio)、黑頭呆魚(Pimephales promelas)、鯉魚(Cyprinus carpio)及稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)等。海水青鳉魚(Oryzias melastigma)具有體型小、易于飼養(yǎng)、世代周期短、鹽度適應(yīng)范圍廣，并且對環(huán)境污染物反應(yīng)敏感的特點，是理想的海洋環(huán)境監(jiān)測模式生物。

研究發(fā)現(xiàn)魚類Vtg，特別是海洋魚種Vtg，即使在低溫條件下保存也極易發(fā)生降解，并且降解后的Vtg蛋白片段會增加其免疫原性，從而導(dǎo)致ELISA實驗中標(biāo)準(zhǔn)曲線的異常變化，影響ELISA檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。而Vtg降解也被認為是導(dǎo)致ELISA精確度較低的重要原因。卵黃脂磷蛋白(Lipovitellin,Lv)是Vtg在卵巢中的裂解產(chǎn)物，與Vtg具有相似的免疫原性，并且具有極高的熱穩(wěn)定性。因此，利用Lv作為ELISA檢測實驗中的抗原(標(biāo)準(zhǔn)品)將大大增加Vtg檢測的穩(wěn)定性和精確度。然而，目前尚未有研究利用Lv為抗原(標(biāo)準(zhǔn)品)開發(fā)建立海水青鳉魚Vtg ELISA檢測技術(shù)，制約了海水青鳉魚在海洋環(huán)境雌激素污染監(jiān)測中的應(yīng)用。

因此，純化制備高純度的海水青鳉魚Lv，建立以Lv為標(biāo)準(zhǔn)品的海水青鳉魚Vtg ELISA定量檢測方法，改進現(xiàn)有方法的穩(wěn)定性及精確度，具有重要的實際意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種改良的定量檢測海水青鳉魚(Oryzias melastigma)卵黃原蛋白的試劑盒，該試劑盒以海水青鳉魚卵黃脂磷蛋白為抗原標(biāo)準(zhǔn)品，能夠極大提高現(xiàn)有檢測方法的穩(wěn)定性和精確度。該方法的檢測范圍為7.8～1000ng/mL(R²>0.990)，檢出限可以達到3.1ng/mL，組間與組內(nèi)變異系數(shù)分別小于3.85％及4.83％。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種改良的定量檢測海水青鳉魚(Oryzias melastigma)卵黃原蛋白的試劑盒，該試劑盒包括1個盒體，盒體內(nèi)裝有1塊空白96孔酶標(biāo)板；1支海水青鳉魚卵黃脂磷蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，使用前用樣品稀釋液稀釋到所需濃度；1支兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體，使用前用包被液稀釋至5μg/mL；1支辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體，使用前用樣品稀釋液按1：的比例稀釋；包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液及終止液各1支。

所述的包被液為50mM pH 9.6碳酸鹽緩沖液；所述的封閉液為含2％BSA的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液；所述的樣品稀釋液為含0.05％Tween-20及1％BSA的磷酸鹽緩沖液；所述的洗滌液為含0.05％Tween-20的150mM pH 7.4的磷酸鹽緩沖液；所述的顯色液為TMB單組分顯色液；所述的終止液為2M的H₂SO₄水溶液。

上述試劑盒的制備方法，主要是制備盒體內(nèi)的海水青鳉魚卵黃脂磷蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體，包括以下步驟：

所述的海水青鳉魚卵黃脂磷蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，包括以下步驟：