[發(fā)明專利]一種改良的定量檢測海水青鳉魚卵黃原蛋白的試劑盒、制備方法及應(yīng)用

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• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107367617A
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宮玉峰;易先亮;鐘熙;張紹帥
• 申請（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/74;G01N33/531
• 代理公司: 大連理工大學(xué)專利中心21200
• 代理人: 李曉亮,潘迅

1.一種改良的定量檢測海水青鳉魚卵黃原蛋白的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括1個盒體，盒體內(nèi)裝有1塊空白96孔酶標(biāo)板；1支海水青鳉魚卵黃脂磷蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，使用前用樣品稀釋液稀釋至所需濃度；1支兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體，使用前用包被液稀釋至5μg/mL；1支辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體，使用前用樣品稀釋液按1：2500的比例稀釋；包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液及終止液各1支；

所述的包被液為碳酸鹽緩沖液；封閉液、樣品稀釋液、洗滌液為磷酸鹽緩沖液；顯色液為單組分顯色液；終止液為H₂SO₄水溶液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良的定量檢測海水青鳉魚卵黃原蛋白的試劑盒，其特征在于，所述的包被液為50mM的碳酸鹽緩沖液，pH 9.6；所述的封閉液為含2％BSA的磷酸鹽緩沖液，pH 7.4；所述的樣品稀釋液為含0.05％Tween-20及1％BSA的磷酸鹽緩沖液；所述的洗滌液為含0.05％Tween-20的150mM的磷酸鹽緩沖液，pH 7.4；所述的顯色液為TMB單組分顯色液；所述的終止液為2M的H₂SO₄水溶液。

3.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒的制備方法，其特征在于制備盒體內(nèi)的海水青鳉魚卵黃脂磷蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體，包括以下步驟：

所述的海水青鳉魚卵黃脂磷蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，包括以下步驟：

1)取卵黃形成后期的雌性海水青鳉魚卵巢組織，去除結(jié)締組織，收集魚卵；加入魚卵3～4倍體積、4℃預(yù)冷的勻漿緩沖液，4℃機(jī)器勻漿后，10000rpm/min離心20分鐘，收集上清液；所述的勻漿緩沖液為25mM氨基丁三醇Tris，內(nèi)含0.07M NaCl和0.5TIU/mL抑肽酶，并用HCl或NaOH調(diào)整pH值為7.6；

2)向上清液中緩緩加入(NH₄)₂SO₄粉末至70％的飽和度，鹽析過液；10小時后，在4℃下，以8000rpm/min離心10分鐘，棄去上清液，將沉淀重新溶解于25mM Tris-HC緩沖液中，獲得卵勻漿提取液；

3)取1mL卵勻漿提取液加入至層析柱，用含0.07M NaCl的25mM Tris-HCl緩沖液洗脫；收集含有海水青鳉魚卵黃脂磷蛋白的洗脫峰進(jìn)行離子交換層析，分別用含0.07M、0.1M、0.2M、0.3M和1.0M NaCl的25mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行不連續(xù)洗脫，收集0.2M洗脫組分，即為海水青鳉魚卵黃脂磷蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；

所述的兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體的制備方法，包括以下步驟：

1)采用水體暴露17β-雌二醇的方法誘導(dǎo)海水青鳉魚合成卵黃原蛋白，其中，17β-雌二醇的暴露濃度為50～200μg/L；

2)取暴露后的海水青鳉魚，稱重，并加入海水青鳉魚3倍質(zhì)量的勻漿緩沖液，冰浴勻漿，勻漿液低溫離心后收集上清液；

3)將收集到的上清液用凝膠過濾層析，用25mM Tri-HCl勻漿緩沖液沖流洗脫層析柱，收集主洗脫峰得到洗脫液，其中，25mM Tri-HCl勻漿緩沖液內(nèi)含0.07M NaCl和0.5TIU/mL抑肽酶，pH 7.6；再將洗脫液加入陰離子交換層析柱，分別用含有0.07、0.1、0.2和1M NaCl的25mM Tris-HCl勻漿緩沖液繼續(xù)沖流洗脫層析柱，每個梯度沖洗60min，收集0.2M洗脫峰，獲得海水青鳉魚卵黃原蛋白，其中，25mM Tris-HCl勻漿緩沖液內(nèi)含0.5TIU/mL抑肽酶，pH 7.5；

4)取海水青鳉魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后制成免疫試劑，對白兔進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量0.1mL；每隔兩周加強(qiáng)免疫1次，單次免疫試劑的劑量為600μg，并使用弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，連續(xù)加強(qiáng)免疫5次；第5次免疫后5天心臟采血，6000r/min離心20分鐘，收集血漿，獲得兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白多克隆抗血清；向抗血清中加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4℃震蕩2小時后離心，棄去上清液，沉淀用10mL PBS緩沖液溶解；獲得的溶液過濾后加入親和層析柱中，以PBS緩沖液洗脫后，用pH 2.7的0.1M甘氨酸洗脫，獲得兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體；

所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體的制備方法，包括以下步驟：

稱取6mg辣根過氧化物酶溶解于2mL去離子水中，加入0.4mL濃度為0.1M的NaIO₄溶液，室溫、避光條件下攪拌后，將溶液裝入透析袋中，用1mM pH4.4的醋酸鈉緩沖液4℃避光透析8-12小時；向其中加入0.5mL 0.16M的乙二醇水溶液，室溫放置后加入3mg兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體，并混合均勻，裝入透析袋中，用0.05M pH 9.5的碳酸鹽緩沖液4℃避光透析8-12小時；向其中加入0.1mL 5mg/mL的NaBH₄溶液，混合均勻后4℃放置；緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4℃離心后棄去上清液，利用0.15M pH 7.4的PBS緩沖液溶解沉淀；裝入透析袋中，用PBS緩沖液4℃避光透析8-12小時；3000r/min離心獲取上清液即為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體。