[發(fā)明專利]一種可視化基因芯片檢測(cè)肺部感染病原菌的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710517219.2
• 申請(qǐng)日: 2017-06-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107164526A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫振學(xué);楊長(zhǎng)春;陳金宏;楊貴榮;張旭;鄒德勇;段媛媛;高敏;趙海濱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)總醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京紐樂(lè)康知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11210
• 代理人: 田磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)，涉及一種可視化基因芯片檢測(cè)肺部感染病原菌的方法。

背景技術(shù)

長(zhǎng)期以來(lái)，呼吸道病原體引起的急性重癥肺部感染一直是威脅人類健康的重要疾病，如不能得到及時(shí)有效救治，不僅可引起呼吸衰竭，還可導(dǎo)致多器官功能障礙，嚴(yán)重威脅患者生命，近20年來(lái)，肺部感染的細(xì)菌譜發(fā)生了變化，是當(dāng)前醫(yī)務(wù)工作者面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。對(duì)病原菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，是臨床診治肺部感染的前提與關(guān)鍵，對(duì)于降低患者死亡率，減少住院時(shí)間、降低住院費(fèi)用及避免醫(yī)療資源的浪費(fèi)具有重要意義。

目前我國(guó)對(duì)于感染性疾病的病原菌檢測(cè)、鑒定手段仍停留在培養(yǎng)、血清和生化檢測(cè)水平。病原菌檢測(cè)的經(jīng)典方法是細(xì)菌培養(yǎng)，其作為病原菌檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，至少需要3-5天時(shí)間，對(duì)于一些非典型菌株培養(yǎng)則需時(shí)間更長(zhǎng)，不能在第一時(shí)間給臨床醫(yī)生提供詳盡的病原菌信息，導(dǎo)致臨床治療多僅憑經(jīng)驗(yàn)用藥，嚴(yán)重影響治療準(zhǔn)確性及效果。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)在病原學(xué)檢測(cè)方面得到了迅猛發(fā)展，PCR等雖然有較好的特異性及靈敏性，但每次只能檢測(cè)一種或幾種致病菌，存在通量低的缺陷，只能作為常規(guī)檢測(cè)方法的補(bǔ)充和輔助。因此，臨床迫切需要對(duì)肺部感染的病原體進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，以指導(dǎo)抗感染藥物選擇，提高臨床治療效果。利用高新分子生物學(xué)技術(shù)，建立多種感染性致病菌的快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)方法，使之操作簡(jiǎn)便、適合臨床應(yīng)用，確保臨床醫(yī)生在較短的時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確獲得病原菌結(jié)果，對(duì)于提高肺部感染的診治和防控能力，防止疾病的傳播，都具有重要的價(jià)值。

基因芯片技術(shù)為病原微生物的診斷提供了一種強(qiáng)有力的手段。基因芯片(Gene chip)又稱為DNA微陣列(DNA microarray)，該技術(shù)采用原位合成或微量點(diǎn)樣方法，將大量DNA探針如基因片段、人工合成的寡核苷酸等有序固定在載體(玻璃、硅片、尼龍膜等表面)與標(biāo)記的核酸樣品雜交后通過(guò)計(jì)算機(jī)等信號(hào)處理系統(tǒng)獲取樣品核酸序列信息。與傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)相比較，具有準(zhǔn)確、快速、高通量、平行化等無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)鑒定已顯示出良好的應(yīng)用前景。

基因芯片技術(shù)主要包括四個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)：芯片微陣列制備、樣品制備、生物分子反應(yīng)、信號(hào)的檢測(cè)與分析。基因芯片上的探針設(shè)計(jì)是決定芯片檢測(cè)效能的關(guān)鍵因素之一，16S rRNA基因在細(xì)菌的分類鑒定學(xué)上具有重要的生物學(xué)意義，其在生物進(jìn)化過(guò)程中比其他基因演變得慢，被稱為“細(xì)菌進(jìn)化的活化石。迄今為止，幾乎所有已知細(xì)菌16S rRNA基因的堿基序列已被測(cè)定并存入基因庫(kù)。一般認(rèn)為，對(duì)于同一種細(xì)菌其基因組的同源性應(yīng)大于70％，對(duì)16SrRNA而言，如果出現(xiàn)3個(gè)以上堿基差異就可斷定細(xì)菌不屬于同一種屬，因此，可設(shè)計(jì)出針對(duì)所有細(xì)菌共同的PCR反應(yīng)引物。基因芯片用于細(xì)菌分類鑒定，常用的檢測(cè)區(qū)域和目的基因有：16S rRNA、23S rRNA、16S～23S rRNA ISR(基因間隔區(qū))等。但現(xiàn)有的序列特異性探針設(shè)計(jì)算法缺乏足夠的覆蓋度、靈活性以及效率，不能滿足大規(guī)模細(xì)菌檢測(cè)基因芯片的設(shè)計(jì)要求，而采用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的基于相對(duì)熵和遺傳算法的組合探針設(shè)計(jì)，使得基于組合探針識(shí)別的大規(guī)模細(xì)菌分類16S rRNA基因芯片設(shè)計(jì)成為可能。

芯片的信號(hào)采集和分析方法是獲得病原菌感染結(jié)果的關(guān)鍵步驟。目前，熒光檢測(cè)法是基因芯片常規(guī)檢測(cè)方法，方法成熟、簡(jiǎn)便，能夠達(dá)到一般的檢測(cè)要求，但有機(jī)熒光染料有自身難以克服的缺點(diǎn)：易淬滅、信號(hào)強(qiáng)度低等，在各種環(huán)境中穩(wěn)定性差，影響檢測(cè)信號(hào)的均一性和實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性，其最大的缺點(diǎn)是檢測(cè)儀器的昂貴、體積笨重，檢測(cè)成本較高，限制了基因芯片的臨床及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用與推廣，也是生物芯片技術(shù)發(fā)展面臨的瓶頸問(wèn)題。為解決這個(gè)問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索研究基因芯片的可視化技術(shù)。可視化芯片即可用肉眼直接觀察到生物大分子的反應(yīng)信號(hào)，其原理是在酶的催化作用下產(chǎn)生的沉淀，沉積在芯片表面，使芯片的厚度發(fā)生變化，致使反射在芯片上的光的波長(zhǎng)發(fā)生改變，由此可以通過(guò)芯片上顏色的變化來(lái)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。