[發明專利]一種基于生物3D打印水凝膠的三維肝癌組織構建的方法

在審

• 申請號: 201710514881.2
• 申請日: 2017-06-29
• 公開（公告）號: CN107400661A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 崔曉峰;高桂芳
• 申請（專利權）人: 武漢楓霖科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;B33Y10/00;B33Y70/00;C08F289/00;C08F220/08;G01N5/04
• 代理公司: 北京一格知識產權代理事務所(普通合伙)11316
• 代理人: 滑春生

技術領域

本發明屬于生物學和組織工程學技術領域，具體涉及一種基于生物3D打印水凝膠的三維肝癌組織構建的方法。

背景技術

藥物研發需要經過體內及體外實驗，肝癌細胞系HepG2在傳統的2D培養中在藥物篩選及組織工程已經具有廣泛的研究和應用，但2D培養體系在長期的培養過程中存在細胞形態及功能上的缺失，許多指標無法客觀評價，依然是需要攻克的難題。3D培養系統能更好的模擬細胞在人體的生長環境，具有比2D更加完善的培養體系，正廣泛應用于各個領域。

3D培養體系需要借助不同的生物材料來實現，膠原、納米材料等生物支架材料在組織工程中均具有廣泛的應用。細胞生長需要一定的機械強度，GelMA由酰基化的gelatin合成，具有良好的吸水性和機械性能。肝組織工程得到的微型肝組織具有比2D更好的形態和功能上的優勢，細胞與細胞間能形成緊密聯系和彼此融合，形成具有一定生物學功能的肝組織。其更加完善的功能可用于體外藥物篩選和評價以及3D打印方向的應用。

綜上所述，肝臟組織工程領域迫切需要開發一種新的構建微型肝組織的方法，在能夠有效達到培養微型肝組織目的的同時，還能有效改善2D培養體系在完整肝功能上的缺陷。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，現提供一種可靠、操作簡便、可重復性強，能夠有效促進肝癌組織功能的形成的基于生物3D打印水凝膠的三維肝癌組織構建的方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：一種基于生物3D打印水凝膠的三維肝癌組織構建的方法，其創新點在于：包括以下步驟：

（1）合成GelMA支架材料，并且檢測酰基化率和光聚時間，然后配置光引發劑，保存備用；

（2）將GelMA與光引發劑均勻混合溶解后，將人肝癌細胞HepG2 與GelMA溶液混勻3D打印并光聚成細胞與水凝膠的復合體，然后加入10% FBS培養液中培養7天，即制備成含有HepG2來源的肝癌組織工程化單元，保存備用；

（3）檢測三維肝癌組織材料的溶脹比及平衡水含量；

（4）采用BE組化方法檢測2D及3D第7天時的生長狀態。

進一步的，所述步驟（1）中的GelMA支架材料的合成具體方法為：稱取1克明膠溶于10毫升的去離子水中，50℃水浴保溫；劇烈攪拌并加入0.6毫升甲基丙烯酸酐，反應4小時；降溫至40℃并逐漸緩慢倒入1:4（v/v）的冰丙酮中沉淀，4℃ 4000轉/分鐘離心10分鐘，棄上清；將沉淀在40℃下，用去離子水透析72小時。

進一步的，所述步驟（1）中的光引發劑采用PBS配制得到光引發劑I2959，保存備用，所述將GelMA支架材料進行水浴溶解，至最終濃度為10%。

進一步的，所述步驟（2）具體方法為：將GelMA與光引發劑均勻混合溶解后得到GelMA溶液，然后將人肝癌細胞HepG2、GelMA溶液混勻，細胞濃度調整為1x10⁶/mL，制成生物打印墨水，生物打印的細胞與水凝膠體系置于紫外燈下光聚5分鐘固化，將固化的水凝膠放入培養箱中繼續培養7天，每2天更換新鮮培養液，觀察支架內細胞生長狀態。

進一步的，所述步驟（3）具體方法為：分別將無細胞GelMA水凝膠，培養第0天生物3D打印水凝膠，培養第3天生物3D打印水凝膠，培養第7天生物3D打印水凝膠分別放入PBS內37^oC充分吸水3天，取出稱各組濕重W_濕重，并凍干48 h后稱各組干重W_干重，計算各組溶脹比及平衡水含量。

本發明的有益效果如下：本發明可靠、操作簡便、可重復性強，能夠有效促進肝癌組織功能的形成，能夠為肝組織工程的科學研究以及肝癌的臨床治療提供有益的參考，并且為生物打印技術的臨床化提供有效的方法及技術支撐。

附圖說明

圖1為本發明的GelMA空白水凝膠完全吸水及凍干后的形態對比圖；

圖2為本發明中GelMA空白水凝膠，GelMA-細胞水凝膠分別培養0天、3天、7天后的質量溶脹比的對比圖；

圖3為本發明中GelMA空白水凝膠，GelMA-細胞水凝膠分別培養0天、3天、7天后的平衡水含量的對比圖；

圖4為本發明2D及3D培養體系下第7天時的HE染色圖。

具體實施方式

以下由特定的具體實施例說明本發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點及功效。