[發明專利]一種用于檢測油菜莖基潰瘍病菌的引物探針組合及檢測方法

在審

• 申請號: 201710511735.4
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107099613A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 雷榮;吳品珊;邵思;陳乃中;朱水芳
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,何葉喧

技術領域

本發明涉及農業和植物檢疫技術領域，具體涉及一種用于檢測油菜莖基潰瘍病菌的引物探針組合及檢測方法。

背景技術

油菜莖基潰瘍病是油菜上最嚴重的真菌病害之一，其致病菌為小球腔菌屬的油菜莖基潰瘍病菌(Leptosphaeria maculans)，該病菌致病力強，能引起油菜莖基部發生潰爛，嚴重時可導致油菜減產達30％-50％，甚至更高。油菜莖基潰瘍病菌在澳大利亞、加拿大、美國、歐洲等油菜主產國有發現，而在中國未見報道，屬于中國進境植物檢疫性有害生物。近年來，在我國出入境檢驗檢疫機構從進口澳大利亞、烏克蘭和加拿大等國進境油菜籽中多次截獲莖基潰瘍病菌L.maculans。中國油菜產區氣候與澳大利亞、美國、歐洲三大州相似，且中國目前的油菜主要栽培品種高度感病。此外，隨著貿易全球化，病菌傳入的風險加劇。為防止油菜莖基潰瘍的傳入，高效快速檢測成為預防油菜莖基潰瘍病傳入中國的技術關鍵。

目前，用于油基莖基潰瘍病菌的檢測方法主要有濾紙培養法、PCR方法和環介導等溫擴增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)檢測方法。常規PCR必須經過變性、退火、延伸三個步驟，用時在90分鐘左右。LAMP擴增方法針對靶基因序列的6個不同區域設計4種特異性LAMP引物，利用一種鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在等溫條件(63℃左右)孵育30-60min，完成擴增。重組酶介導等溫擴增(RPA)技術被認為是可以取代PCR的核酸檢測技術。RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最適溫度在37℃-42℃之間，無需變性，在常溫下即可進行。這無疑能大大加快核酸擴增速度。RPA檢測的靈敏度很高，能夠將痕量的核酸(尤其是DNA)模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約1012擴增產物。而且RPA還用不著復雜的樣品處理，適用于無法提取核酸的實地檢測。此外，由于不需要溫控設備，RPA可以真正實現便攜式的快速核酸檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測油菜莖基潰瘍病菌的引物探針組合及檢測方法。

本發明提供了一種引物對，由引物F和引物R組成；

所述引物F為如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R為如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子。

本發明還保護引物探針組合，由所述引物對和探針組成；

所述探針如下所示：

區段A-(dT-熒光基團)-四氫呋喃殘基-(dT-猝滅基團)-區段B；

在所述探針的3'端進行修飾；

所述區段A如序列表的序列3所示；

所述區段B如序列表的序列4所示。

所述熒光基團為FAM；所述淬滅基團為BHQ1。

所述“在所述探針的3'端進行修飾”為采用C3-spacer或磷酸鹽或生物素-TEG或胺進行修飾。

所述引物對或所述引物探針組合的用途為如下(b1)-(b4)中的至少一種：

(b1)鑒定或輔助鑒定待測菌株是否為油菜莖基潰瘍病菌；

(b2)檢測待測樣本中是否含有油菜莖基潰瘍病菌；

(b3)制備用于鑒定或輔助鑒定待測菌株是否為油菜莖基潰瘍病菌的試劑盒；

(b4)制備用于檢測待測樣本中是否含有油菜莖基潰瘍病菌的試劑盒。

本發明還保護所述引物對或所述引物探針組合的應用，為如下(b1)-(b4)中的至少一種：

(b1)鑒定或輔助鑒定待測菌株是否為油菜莖基潰瘍病菌；

(b2)檢測待測樣本中是否含有油菜莖基潰瘍病菌；

(b3)制備用于鑒定或輔助鑒定待測菌株是否為油菜莖基潰瘍病菌的試劑盒；

(b4)制備用于檢測待測樣本中是否含有油菜莖基潰瘍病菌的試劑盒。

本發明還保護含有所述引物對的試劑盒甲，或，含有所述引物探針組合的試劑盒乙；所述試劑盒的用途為如下(c1)或(c2)：

(c1)鑒定或輔助鑒定待測菌株是否為油菜莖基潰瘍病菌；

(c2)檢測待測樣本中是否含有油菜莖基潰瘍病菌。