[發明專利]用動物腸粘膜生產腸道微生物粉并聯產小分子肽、肝素鈉、堿性磷酸酶的方法及應用

在審

• 申請號: 201710511309.0
• 申請日: 2017-06-29
• 公開（公告）號: CN107345207A
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發明（設計）人: 王德亮;王皓林
• 申請（專利權）人: 王德亮
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12N1/20;C07K1/34;C08B37/00;C12N9/16;A61K35/741;A61P1/00
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

1.一種用動物腸粘膜生產腸道微生物粉并聯產小分子肽、肝素鈉、堿性磷酸酶的方法，其特征在于：是以動物腸粘膜為原料，應用現代生物過程集成化技術，在同一生產工藝流程中，生產出腸道微生物粉、小分子肽、肝素鈉、堿性磷酸單酯酶4種功能成份，包括以下步驟：

（1）將動物腸粘膜粉碎，打漿；

（2）加入2-3倍體積的0.9%生理鹽水溶解；

（3）用離心機3000-5000 r/min離心10-15min，收集離心液，去除不溶物；

（4）將收集的離心液，依次過1.0μm、0.65μm、0.22μm的濾膜，收集過濾液和膜上未過濾物；合并膜上未過濾物，經蒸發干燥即為腸道微生物粉；

（5）合并收集的膜過濾液，經過截留分子量一萬的超濾裝置，分別收集透過液和截留液，透過液即小分子肽液，濃縮后即為口服液原料；

（6）將步驟（5）中的截留液，加正丁醇沉淀；用高速離心機離心，分別收集離心液和固態離心物；

（7）將步驟（6）中收集的離心液，用等體積冷丙酮沉淀，出現沉淀物后，于速度3000-6000r/min離心5分鐘，收集沉淀物，此沉淀物離心后立即加熱到丙酮沸點，使丙酮渾發；

（8）將步驟（7）收集的沉淀物加入3-5倍量的0.05 mol/L，Tris—HC1緩沖液，該緩沖液PH7.5，含0.01mol/L氯化鎂，0.01mol/L氯化鈉，0.01mol/L氯化鋅；充分混合攪拌，得堿性磷酸單酯酶粗液；

（9）將步驟（6）高速離心機收得的固態物用于生產肝素鈉。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：將步驟（8）中所得的堿性磷酸單酯酶粗液經上柱、洗脫、收集、真空干燥得堿性磷酸單酯酶，具體過程如下：

A、上DEAL-separ0se4B柱，此柱用pH7.5、0.05 mol/L的Tris-HC1緩沖液平衡過；

B、用含有氯化鈉的pH7.5的0.05 mol/L，Tris-HC1緩沖液線性梯度洗脫；

C、用280nm檢測洗脫峰，收集峰高洗脫液；

D、用磷苯二鈉為底物檢測收集洗脫液酶活性，合并活性酶洗脫液；

E、將上述活性酶用旋轉薄板蒸發器在35℃下真空干燥得粉劑，即堿性磷酸單酯酶。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（9）中生產肝素鈉的具體方法如下：

A、將固態物用三倍量的0.9%生理鹽水溶解；

B、用40%NaOH溶液調pH至8.0-9.0，加熱攪拌到60℃保溫二小時；

C、按比例加入0.20-0.25%的固態胰蛋白酶，酶解三小時，溫度保持在37℃，pH在8.0-9.0之間；

D、趁熱過濾，收集過濾液，用10%HCl調節pH5.5-6.0，立即升溫至95℃，在攪拌下按比例5%加入氯化鈉；

E、使蛋白質與肝素鈉分離；

F、保溫，當出現有沉淀物下降，立即過濾收濾渣，處理后作動物蛋白飼料；濾液在用6000-10000 r/min離心，收集離心液，將離心液冷卻到5-8℃；

G、緩慢過D-254樹脂柱，控制流速，使肝素鈉充分被樹脂吸附；該D-254樹脂裝柱事先要用酸、堿平衡好；

H、吸附罷的柱子，用3%的氯化鈉液洗滌，除去非肝素鈉物質；

I、再用5%的氯化鈉液洗脫柱子，收集洗脫液；將收集的洗脫液加入乙醇，使溶液酒精終濃度達到43-45%，靜置6小時，收集沉淀物；

J、沉淀物用無水乙醇脫水，再用丙酮脫水,脫水的肝素鈉在50℃真空干燥即得粗品肝素鈉。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：在步驟（4）中，采用生理鹽水收集過濾液和膜上未過濾物。

5.一種由權利要求1所述方法生產的腸道微生物粉移植進入人體腸內的應用，既可補充有益菌，使有益菌與有害菌在腸道處于平衡，還恢復了腸道與微生物的微環境，可達到延年益壽的作用。