[發明專利]一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法

有效

• 申請號: 201710509371.6
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107164326B
• 公開（公告）日: 2020-04-10
• 發明（設計）人: 張洪鈿;苑春慧
• 申請（專利權）人: 北京再生生物科技研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 北京紐樂康知識產權代理事務所(普通合伙) 11210
• 代理人: 黃敏華

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，具體來說，涉及一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法。

背景技術

神經干細胞和神經祖細胞是神經元、神經膠質細胞等神經細胞的前體細胞，目前還沒有準確區分二者的方法。神經前體細胞（neural precursor cells，NPCs）在神經系統發育和神經損傷修復過程中起重要作用，成體神經損傷修復困難與NPCs缺乏或沉默有關。既往的研究表明，移植同種異體NPCs能緩解帕金森、多發性硬化、腦膠質瘤等疾病，能促進神經退行性疾病、外傷等軸突損傷髓鞘新生和修復，緩解臨床癥狀，但存在免疫排斥反應，嵌合率低，自體NPCs移植的醫療前景更令人期待。成體NPCs的分離依賴于組織學部位，一般成年人體內很難取材，而流產胎兒腦組織分離NPCs又受到倫理學限制，樣本資源成為限制NPCs研究和應用的瓶頸。近些年來，對干細胞分化機制的研究取得了很大進展，發現胚胎干細胞和多種成體干細胞有神經前體細胞分化潛能，為神經前體細胞制備提供了新的思路。MSCs是樣本資源最豐富的成體干細胞，是基于干細胞再生醫學的最有前景的種子細胞。脂肪、臍帶、骨髓等多種組織來源的間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）能分化成netstin+神經前體細胞，具有神經元、神經膠質細胞等的分化潛能。骨髓樣本采集對供者負擔大、顧慮多，但臨床抽脂技術非常成熟，相比于臍帶等圍產期組織和自體骨髓，自體脂肪MSCs衍生NPCs移植治療神經損傷具有更多的樣本來源優勢。目前的研究發現，使用EGF、bFGF等細胞因子可以誘導MSCs向神經組織細胞分化。但如果要得到均一性高的nestin+NPCs則需要經過神經球培養階段。神經球培養是將MSCs接種至疏水培養容器中培養，形成多細胞聚集的細胞球，屬于半懸浮培養體系，其培養容量小、操作復雜、難于傳代擴增，導致細胞收率低，限制了基于NPCs的神經組織修復醫學的產業化轉化。

針對相關技術中的問題，目前尚未提出有效的解決方案。

發明內容

針對相關技術中的上述技術問題，本發明提出一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，能夠批量培養高純度的自體脂肪MSCs來源NPCs。

為實現上述技術目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，包括如下步驟：

S1.制備膠原3D支架；

S2.采集脂肪組織，分離脂肪細胞，以MSCs培養基培養收獲P0代MSCs，P0代MSCs以MSCs培養基重懸，培養收獲P1代MSCs；

S3.預處理膠原3D支架；

S4.以MSCs培養基重懸P1代MSCs，接種至含膠原3D支架的組織培養皿中，使用NPCs培養基繼續培養6天，收獲NPCs。

進一步地，所述制備膠原3D支架的方法為：將膠原海綿修剪成片，將若干個膠原海綿片垛疊在一起為一個培養單位，以含重組人層黏連蛋白、重組人玻連蛋白的DMEM/F12浸泡，孵育過夜，以生理鹽水浸泡漂洗，淋干后置于無菌密封容器中，于4℃保存不超過30天，備用。

進一步地，所述步驟S2中分離脂肪細胞的方法為：剔除小血管和結締組織，剪碎呈流體狀；用生理鹽水重懸離心后取脂肪層和沉淀層，以消化液消化，37℃水浴30分鐘，每5分鐘充分振蕩；去懸浮絮狀物，篩網過濾，濾液離心棄上清，以PBS重懸，靜置，吸棄懸浮物后離心棄上清。

進一步地，所述步驟S2中培養收獲P0代MSCs的方法為：以MSCs培養基重懸脂肪細胞，調整細胞密度為5×10⁵/mL，接種至組織培養瓶中，于CO₂培養箱內培養至70-80%匯合時收獲；收獲時吸棄培養上清，生理鹽水洗滌培養表面，加入胰蛋白酶溶液，室溫消化5分鐘，加入抑肽酶溶液終止消化；400g離心5min，棄上清，收獲沉淀物；生理鹽水洗滌后，以細胞篩過濾，濾液400g離心5min，棄上清，收獲沉淀細胞，記為P0代MSCs。

進一步地，所述步驟S2中培養收獲P1代MSCs的方法為：P0代MSCs以MSCs培養基重懸，調整細胞密度為6000個/cm²，接種至組織培養瓶，于CO₂培養箱內培養至70-80%匯合時收獲P1代MSCs。