[發明專利]一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法

有效

• 申請號: 201710509371.6
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107164326B
• 公開（公告）日: 2020-04-10
• 發明（設計）人: 張洪鈿;苑春慧
• 申請（專利權）人: 北京再生生物科技研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 北京紐樂康知識產權代理事務所(普通合伙) 11210
• 代理人: 黃敏華

1.一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.制備膠原3D支架；

S2.采集脂肪組織，分離脂肪細胞，以MSCs培養基培養收獲P0代MSCs，P0代MSCs以MSCs培養基重懸，培養收獲P1代MSCs；

S3.預處理膠原3D支架；

S4.以MSCs培養基重懸P1代MSCs，接種至含膠原3D支架的組織培養皿中，使用NPCs培養基繼續培養6天，收獲NPCs。

2.根據權利要求1所述的一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，其特征在于，所述制備膠原3D支架的方法為：將膠原海綿修剪成片，將若干個膠原海綿片垛疊在一起為一個培養單位，以含重組人層黏連蛋白、重組人玻連蛋白的DMEM/F12浸泡，孵育過夜，以生理鹽水浸泡漂洗，淋干后置于無菌密封容器中，于4℃保存不超過30天，備用。

3.根據權利要求1所述的一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，其特征在于，所述步驟S2中分離脂肪細胞的方法為：剔除小血管和結締組織，剪碎呈流體狀；用生理鹽水重懸離心后取脂肪層和沉淀層，以消化液消化，37℃水浴30分鐘，每5分鐘充分振蕩；去懸浮絮狀物，篩網過濾，濾液離心棄上清，以PBS重懸，靜置，吸棄懸浮物后離心棄上清。

4.根據權利要求1所述的一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，其特征在于，所述步驟S2中培養收獲P0代MSCs的方法為：以MSCs培養基重懸脂肪細胞，調整細胞密度為5×10⁵/mL，接種至組織培養瓶中，于CO₂培養箱內培養至70-80%匯合時收獲；收獲時吸棄培養上清，生理鹽水洗滌培養表面，加入胰蛋白酶溶液，室溫消化5分鐘，加入抑肽酶溶液終止消化；400g離心5min，棄上清，收獲沉淀物；生理鹽水洗滌后，以細胞篩過濾，濾液400g離心5min，棄上清，收獲沉淀細胞，記為P0代MSCs。

5.根據權利要求1所述的一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，其特征在于，所述步驟S2中培養收獲P1代MSCs的方法為：P0代MSCs以MSCs培養基重懸，調整細胞密度為6000個/cm²，接種至組織培養瓶，于CO₂培養箱內培養至70-80%匯合時收獲P1代MSCs。

6.根據權利要求1所述的一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，其特征在于，所述步驟3中預處理膠原3D支架的方法為：將5片直徑8cm的膠原3D支架垛疊在一起，置于組織培養皿中，加入MSCs培養基，置于于37℃，5%CO₂培養箱內培養過夜，取出膠原3D支架，淋干培養基，轉移至新的組織培養皿中備用。

7.根據權利要求1所述的一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，其特征在于，培養收獲NPCs的方法為：以MSCs培養基重懸P1代MSCs，調整細胞密度至2×10⁶/mL，吸取30mL細胞懸液，接種至含膠原3D支架的15cm組織培養皿中，置于于37 ℃，5%CO₂培養箱內培養4天，取出膠原3D支架，淋干培養基，轉移至新的15cm組織培養皿中，補充30mL NPCs培養基培養6天，收獲；收獲時吸棄NPCs培養基，生理鹽水浸泡5分鐘，更換若干次生理鹽水至無色，加入消化液室溫消化10分鐘，加入抑肽酶溶液終止消化；吸取消化液，以生理鹽水洗滌膠原3D支架，合并消化液和洗液，以細胞篩過濾，濾液400g離心5min，棄上清，收獲沉淀物，即為NPCs。

8.根據權利要求1所述的一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，其特征在于，所述NPCs培養基為含有如下物質的DMEM/F12：

1 × B27，

10%無動物源成分血清替代品，

0.1nM人二氫睪丸酮，

40ng/ml全反式維甲酸，

50ng/mL重組人堿性成纖維細胞生長因子，

25ng /mL重組人表皮生長因子，

2mM L-谷氨酰胺。

9.根據權利要求1所述的一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，其特征在于，所述步驟S2中，所述脂肪組織來源于腹部脂肪。

10.根據權利要求9所述的一種3D培養自體脂肪MSCs來源的神經前體細胞的方法，其特征在于，采集脂肪組織前對脂肪提供者體檢，提供者應無腫瘤史、無病毒感染、無支原體感染，采集后立即置于含保存液的冰浴無菌瓶中，所述保存液為含有50ug/mL硫酸慶大霉素的DMEM/F12。