[發(fā)明專利]光學(xué)純meso-2,3-丁二醇高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710509034.7
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107201374B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃艷燕;黃日波;謝能中;李檢秀;陳先銳;王青艷;陳東;杜奇石
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/60;C12N1/21;C12P7/18
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 45123
• 代理人: 黃南概

本發(fā)明公開了一種光學(xué)純meso?2,3?丁二醇高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建，該構(gòu)建方法是將α?乙酰乳酸合成酶基因、α?乙酰乳酸脫羧酶基因和meso?2,3?丁二醇脫氫酶基因的核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，然后拼接獲得包含該三個基因的基因簇，再將基因簇導(dǎo)入表達(dá)載體中獲得多順反子重組質(zhì)粒，最后將重組質(zhì)粒再導(dǎo)入宿主菌E.coli即得所述高產(chǎn)工程菌，該菌所用的合成原料來源廣泛、成本低，菌株無致病性，菌株產(chǎn)量高、生產(chǎn)效率高、穩(wěn)定性好，最高產(chǎn)量可達(dá)到91.5 g/L，光學(xué)純度可達(dá)99%以上。本發(fā)明同時公開了上述高產(chǎn)工程菌株利用廉價木薯粉為碳源，利用棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆餅粉或花生蛋白粉為氮源在生產(chǎn)光學(xué)純meso?2,3?丁二醇中的應(yīng)用，降低了生產(chǎn)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種光學(xué)純meso-2,3-丁二醇高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法，及其在利用廉價原料生產(chǎn)光學(xué)純meso-2,3-丁二醇中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

2,3-丁二醇(2,3-butanediol)是一種平臺化合物，在化工、食品、能源、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值，其微生物發(fā)酵生產(chǎn)是現(xiàn)代生物化工的重要課題。2,3-丁二醇分子中含有兩個手性碳原子，因此存在三種光學(xué)異構(gòu)體，分別是(2R,3R)-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇。單一構(gòu)型的meso-2,3-丁二醇不僅具有混旋型2,3-丁二醇的基本功能，而且在不對稱合成高附加值化學(xué)品和藥物方面具有巨大的潛在優(yōu)勢，例如用于合成可再生聚酯或者光學(xué)純鹵代醇，具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)化學(xué)合成法獲得的2,3-丁二醇是三種光學(xué)異構(gòu)體的混合物，不但存在過程繁瑣、產(chǎn)率低、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，而且由于不同立體構(gòu)型2,3-丁二醇的物理化學(xué)性質(zhì)相近，手性拆分成本十分高昂，難以實現(xiàn)大規(guī)模低成本生產(chǎn)。因此，開展微生物高效合成單一構(gòu)型meso-2,3-丁二醇的研究具有重要的意義。

與傳統(tǒng)化學(xué)合成法相比，2,3-丁二醇的微生物發(fā)酵法對環(huán)境友好，工藝簡單，符合綠色化工的要求。目前2,3-丁二醇的高產(chǎn)菌種大多屬于致病微生物，如Klebsiellapneumoniae、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Serratia marcescens、Enterobacter cloaca，因此限制了這些菌株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。另外，目前已報道的2,3-丁二醇發(fā)酵菌株所產(chǎn)的2,3-丁二醇多為兩種或三種光學(xué)異構(gòu)體的混合物【Biotechnol Adv,2011,29:351-364】，同樣存在手性拆分、成本高昂的問題。目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純meso-2,3-丁二醇的天然微生物。因此，迫切需要開發(fā)出meso-2,3-丁二醇的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率以及光學(xué)純度高并且安全可靠的代謝工程菌株。

中國專利201410051821.8公開了克隆E.cloacae subsp.dissolvens的2,3-丁二醇合成基因簇，該基因簇包括四個基因，其中l(wèi)ysR編碼2,3-丁二醇合成調(diào)控因子，budA、budB、budC編碼α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脫羧酶、meso-2,3-丁二醇脫氫酶。將該基因簇插入表達(dá)載體pET-28a(+)獲得重組質(zhì)粒pETRABC，導(dǎo)入E.coli獲得工程菌株。該工程菌株meso-2,3-丁二醇最高產(chǎn)量為85g/L，但光學(xué)純度太低，僅為96％，而且為達(dá)到高產(chǎn)需要使用高價原料酵母粉和葡萄糖。此外，pET-28a(+)是高拷貝表達(dá)載體，而且該法需要誘導(dǎo)表達(dá)數(shù)量較多的基因(lysR、budA、budB和budC)，加大了宿主的代謝負(fù)荷，會增加大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的不穩(wěn)定性。而目前使用廉價碳源發(fā)酵生產(chǎn)meso-2,3-丁二醇的方法，則由于菌株的生產(chǎn)能力不足導(dǎo)致meso-2,3-丁二醇產(chǎn)量偏低，或者光學(xué)純度達(dá)不到要求。綜上所示，meso-2,3-丁二醇現(xiàn)有合成技術(shù)中存在原料成本過高、光學(xué)純度太低，產(chǎn)量太低，或者菌株不穩(wěn)定等問題。

發(fā)明內(nèi)容