[發明專利]光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株的構建方法及應用

有效

• 申請號: 201710509034.7
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107201374B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 黃艷燕;黃日波;謝能中;李檢秀;陳先銳;王青艷;陳東;杜奇石
• 申請（專利權）人: 廣西科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/60;C12N1/21;C12P7/18
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務所(特殊普通合伙) 45123
• 代理人: 黃南概

1.一種光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脫羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因的核苷酸序列進行密碼子優化；（2）將經密碼子優化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脫羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因拼接獲得包含該三個基因的基因簇，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；（3）將基因簇插入表達載體中，獲得多順反子重組質粒；（4）將多順反子重組質粒導入宿主菌E. coli，即獲得光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株；

所述宿主菌E. coli為多基因缺失的突變菌株，其通過疊加敲除菌株中合成副產物的關鍵基因而獲得；所述副產物包括(2R,3R)-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇和甲酸；所述合成副產物的關鍵基因包括gldA、dar、frdABCD、ldhA、pta、adhE和pflB。

2.如權利要求1所述構建方法構建而得的基因工程菌株在生產meso-2,3-丁二醇的應用，其特征在于，包括以下步驟：

（1）發酵培養基的制備：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化鈣，在80-100°C液化0.5-5 h，靜置冷卻；當溫度降低至55°C時，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60°C糖化5-20h，調節pH 6.5-7.5，離心或過濾收集上清液，稀釋上清液后在115°C條件下滅菌15min，即得；按1000mL水計，所述發酵培養基各原料組分分別用量為：木薯粉100-200 g，氮源原料40-80 g，液化酶0.5-2 mL，氯化鈣0.01-0.5 g，糖化酶0.2-1 mL，蛋白酶0.05-0.5 g；所述木薯粉是將木薯去皮曬干后經粉碎過50-200目篩制備而得；所述氮源原料為棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆餅粉、花生蛋白粉中的一種或兩種以上組合；

（2）將發酵培養基轉移至發酵罐，然后添加50-100 μg/mL氨芐青霉素，在無菌條件下，將經活化的基因工程菌菌液以體積比為2-10%的接種量接種至發酵培養基中，在溫度35-40°C、攪拌轉速200-600 rpm、通氣量0.2-1.5 vvm條件下培養24-72 h，當檢測發酵液中meso-2,3-丁二醇的濃度不再增加時，發酵結束。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于：所述基因工程菌菌株的活化方法包括以下步驟：將光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株劃線到含有質量體積比為1.5-1.8%瓊脂和含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養10-15 h；在無菌的條件下，用牙簽挑取LB平板上的一個單菌落，然后接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C搖床震蕩培養10-15 h；所述的LB培養基配方為：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化鈉。

4.根據權利要求2所述的應用，其特征在于：在發酵過程中檢測發酵液中葡萄糖的濃度，待葡萄糖濃度降至10-30 g/L時，補加木薯還原糖母液使發酵液中葡萄糖濃度為40-80g/L。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：所述木薯還原糖母液的葡萄糖濃度為500-800 g/L。