[發明專利]一種利用廉價原料生產四甲基吡嗪的方法

有效

• 申請號: 201710509031.3
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107177620B
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 謝能中;黃日波;韋航;李曉明
• 申請（專利權）人: 南寧中諾生物工程有限責任公司;廣西科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P17/12
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務所(特殊普通合伙) 45123
• 代理人: 黃南概

1.一種利用廉價原料生產四甲基吡嗪的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）將α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脫羧酶基因和NADH氧化酶基因的核苷酸序列進行密碼子優化；

（2）將經密碼子優化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脫羧酶基因和NADH氧化酶基因進行拼接獲得包含該三個基因的基因簇；所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（3）將基因簇插入表達載體中，獲得多順反子重組質粒；

（4）將多順反子重組質粒導入宿主菌E. coli，獲得生產乙偶姻的基因工程菌株；所述宿主菌E. coli是多基因缺失的突變菌株，通過疊加敲除菌株中合成副產物的關鍵基因而獲得；所述副產物包括2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸和乙酸；所述合成副產物的關鍵基因包括gldA、frdABCD、ldhA和pta；

（5）對木薯粉、氮源原料進行水解，得發酵培養基，將活化的生產乙偶姻的基因工程菌株接種至發酵培養基進行發酵培養，獲得含有乙偶姻的發酵液；

（6）取上述發酵液進行離心處理，取上清液，再加入磷酸氫二銨，在加熱條件下，乙偶姻與NH₄⁺反應合成四甲基吡嗪。

2.根據權利要求1所述利用廉價原料生產四甲基吡嗪的方法，其特征在于：所述步驟（5）的具體操作步驟為：

S1：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化鈣，在80-100℃下液化0.5-5 h，靜置冷卻；當溫度降低至55℃以下時，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60℃糖化5-20 h，調節pH6.5-7.5，離心或過濾收集上清，稀釋上清液后在115℃條件下滅菌15 min，即得發酵培養基；按1000 mL水計，各組分的用量為：木薯粉100-200 g，氮源原料40-80 g，液化酶0.5-2mL，氯化鈣0.01-0.5 g，糖化酶0.2-1 mL，蛋白酶0.05~0.5 g；所述木薯粉是將木薯去皮曬干后經粉碎過50-200目篩制備而得，所述氮源原料為棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆餅粉中的一種或兩種以上組合；

S2：在無菌條件下，在發酵培養基中添加50-100 μg/mL氨芐青霉素，然后移至發酵罐中，將經活化的生產乙偶姻的工程菌菌液以體積比為1-10%的接種量接種到發酵培養基中，在溫度35-42℃、攪拌轉速200-800 rpm、通氣量0.5-1.5 vvm條件下發酵培養20-72 h，當檢測發酵液中乙偶姻的濃度不再增加時，發酵結束，獲得含有乙偶姻的發酵液。

3.根據權利要求2所述利用廉價原料生產四甲基吡嗪的方法，其特征在于：所述活化的生產乙偶姻的工程菌菌液的制備方法，包括以下步驟：

將生產乙偶姻基因工程菌株劃線到含有質量體積比為1.8%瓊脂和含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，在37℃培養10-15 h；在無菌的條件下，挑取LB平板上的一個單菌落，然后接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體種子培養基中，37℃搖床震蕩培養10-15 h；所述LB培養基的配方為：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化鈉。

4.根據權利要求2所述利用廉價原料生產四甲基吡嗪的方法，其特征在于：在步驟S2的發酵過程中檢測發酵液中葡萄糖的濃度，當葡萄糖濃度降至10-30 g/L時，補加木薯還原糖母液使發酵液中葡萄糖濃度為40-80 g/L；所述木薯還原糖母液的葡萄糖濃度為500-800g/L。

5.根據權利要求2所述利用廉價原料生產四甲基吡嗪的方法，其特征在于：所述步驟（6）的具體操作步驟為：將含有乙偶姻的發酵液離心，去除沉淀，取上清液測定乙偶姻的含量，然后加入乙偶姻1-2.5倍摩爾濃度的磷酸氫二銨，溶解后，調節pH至7.5，在65-95℃水浴搖床中反應6-20 h，即得四甲基吡嗪。

6.根據權利要求5所述利用廉價原料生產四甲基吡嗪的方法，其特征在于：水浴搖床反應過程中加入乙偶姻0.1-2倍摩爾濃度的過氧化氫。