[發明專利]一種利用廉價原料生產四甲基吡嗪的方法

有效

• 申請號: 201710509031.3
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107177620B
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 謝能中;黃日波;韋航;李曉明
• 申請（專利權）人: 南寧中諾生物工程有限責任公司;廣西科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P17/12
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務所(特殊普通合伙) 45123
• 代理人: 黃南概

本發明公開了一種利用廉價原料生產四甲基吡嗪的方法，將α?乙酰乳酸合成酶基因、α?乙酰乳酸脫羧酶基因和NADH氧化酶基因的核苷酸序列進行密碼子優化；拼接獲得包含該三個基因的基因簇；將基因簇插入表達載體中，獲得多順反子重組質粒；再導入宿主菌E.coli，獲得生產乙偶姻的基因工程菌株；將活化的菌株接種至含廉價原料的發酵培養基進行發酵培養，獲得含有乙偶姻的發酵液；取發酵液進行離心處理，取上清液，再加入磷酸氫二銨，發酵產生的乙偶姻與NH₄⁺反應合成四甲基吡嗪。本發明提供的菌株能有效利用來源廣泛、成本低廉的原料生產高濃度前體物質乙偶姻，氧化型輔酶NAD⁺能夠有效再生，可提高乙偶姻產量和生產效率，從而有效降低四甲基吡嗪的生產成本，縮短生產周期。

技術領域

本發明屬于生物化工領域，具體是一種利用廉價原料生產四甲基吡嗪的方法。

背景技術

四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine)又名川芎嗪，是中藥川芎根莖的主要活性生物堿成分，具有擴張血管、改善微循環、抑制血小板黏附聚集和血栓形成等良好的藥理作用，在治療心腦血管疾病、呼吸系統疾病和腎小球疾病等方面具有一定療效，已作為常備藥品廣泛應用于臨床。此外，四甲基吡嗪天然存在于乳制品、豆制品、可可、咖啡、花生、榛子、和白酒中，具有烘烤和堅果的特殊香味。四甲基吡嗪也是是中國白酒中的重要香氣化合物，在中國傳統白酒中均檢測到一定量的四甲基吡嗪，其不僅對中國白酒風味有重要的貢獻，而且還賦予了中國白酒有益健康的功能。四甲基吡嗪香味閾值極低，國家標準GB2760-1996規定其為允許使用的食用香料，目前廣泛應用于烘烤食品、冷飲、肉類、乳制品、卷煙等香精的調配。

四甲基吡嗪的生產方法可分為植物提取法、化學法和生物合成法。利用萃取的方法可從中藥川芎根莖中提取四甲基吡嗪，但是川芎植物來源有限，而且川芎根莖中的四甲基吡嗪含量較低，無法實現大規模的商業化生產。化學法合成四甲基吡嗪的反應條件一般較劇烈，對設備要求較高，普遍存在較嚴峻的環保問題，且產品不屬于“天然”或“生物合成”范疇，安全性和品質問題正在受到不斷的質疑。生物化工方法生產的四甲基吡嗪具有產品綠色天然、成本低、反應條件溫和、環境污染小等優點，隨著人們對綠色產品需求的日益提高，該法受到越來越多的關注。然而，由于利用微生物發酵生產乙偶因并將其轉化為四甲基吡嗪的相關研究起步較晚，通過生物技術途徑生產四甲基吡嗪的技術遠未成熟。

中國專利201010238685.5公開了一種生產四甲基吡嗪的方法及其生產菌株，篩選的Bacillus subtilis XZ1124，Bacillus licheniformis BL-L1、MT-6和MT-15，利用葡萄糖為碳源、酵母膏為氮源時，在發酵罐中乙偶因積累量為30-44g/L，但周期長達72h，而且副產物的積累導致葡萄糖的轉化率太低。發酵液離心取上清加入2倍相應乙偶姻摩爾濃度的磷酸氫二銨，在55-90℃水浴搖床(轉速150rpm)反應20h，四甲基吡嗪的濃度為11-20g/L。該發明工藝較為簡單，但所使用的菌種為野生型菌株，發酵過程中會積累各種副產物，降低了原料的轉化率，進而影響了四甲基吡嗪的得率。微生物發酵生產乙偶姻時，糖酵解過程會產生的大量還原型輔酶NADH，而乙偶姻及四甲基吡嗪的產生并不能消耗NADH，因此微生物細胞會啟動乳酸、乙酸、乙醇、丁二酸等副產物的合成途徑來消耗過量的NADH，實現氧化型輔酶NAD+的再生，這些副產物的積累不但降低了原料的轉化率和四甲基吡嗪產量，還會抑制微生物的生長和發酵。