[發明專利]一種酶法高效制備角膜脫細胞基質組織工程支架的方法

有效

• 申請號: 201710507222.6
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107213515B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 張玉忠;李悅;陳秀蘭;石梅;趙芳;孫鶴敏;宋曉妍
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/50
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

1.一種酶法制備角膜脫細胞基質組織工程支架的方法，其特征在于，步驟如下：

（1）將豬角膜基質板層置于稀釋的Myroilysin酶溶液中，在35～38℃條件下進行脫細胞處理10～18 h，然后生理鹽水、蒸餾水分別沖洗，制得豬角膜脫細胞支架板層；

所述Myroilysin酶溶液，采用如下方法制備：

（i）將經過活化的深海細菌Myroides profundi D25菌株接種于液體發酵培養基中，14～16℃發酵培養70～75 h；將發酵液離心取上清液，向上清液中加入硫酸銨至硫酸銨飽和度為60%，收集沉淀，經Tris-HCl重懸、透析后離心，再經離子交換層析分離純化，G75分子篩分離純化，制得彈性蛋白酶Myroilysin粗酶液；

（ii）將步驟（i）制得的彈性蛋白酶Myroilysin粗酶液經截留分子量為10000 Da的超濾管超濾濃縮，制得濃縮液，然后添加質量百分比15 %的甘油，分裝保存在-80℃，即得；

所述稀釋的Myroilysin酶溶液為用pH 9.0的50 mM Tris-HCl 緩沖液稀釋Myroilysin酶溶液，制得甘油體積百分比占18～22%、Myroilysin酶質量濃度為100～1000 μg/ml的Myroilysin酶溶液；

（2）將步驟（1）制備的將豬角膜脫細胞支架放置在鉆臺上，滴加核黃素溶液20~40 min，并在波長為365 nm的紫外燈下照射30~60 min，然后生理鹽水、蒸餾水分別沖洗，制成核黃素交聯的豬角膜脫細胞支架；

（3）將步驟（2）制得的交聯的豬角膜脫細胞支架經脫水、滅菌，4℃保存待用；

所述脫水為在無菌甘油中脫水22～28 h。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（i）中，離子交換層析為用DEAE陰離子柱通過0～0.8 M的NaCl梯度洗脫分離純化。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（ii）中，濃縮液中Myroilysin酶的濃度為1.8～2.2 mg/ml。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，Myroilysin酶質量濃度為100 μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下處理18 h；Myroilysin酶質量濃度為300 μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下處理16h；Myroilysin酶質量濃度為500 μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下處理16h；Myroilysin酶質量濃度為800 μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下處理10 h；Myroilysin酶質量濃度為1000 μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下處理10 h。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，豬角膜基質板層與稀釋的Myroilysin酶溶液的質量體積比為1：20～30。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，處理為在轉速為80 rpm的條件下震蕩處理。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，核黃素溶液的濃度為1 mg/ml。