[發明專利]一種用于磷酸肽富集和分離的離心式裝置

有效

• 申請號: 201710506881.8
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107167542B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 錢小紅;秦偉捷;張萬軍;孫婕
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: G01N30/08
• 分類號: G01N30/08;G01N30/80
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;王春霞

本發明公開了一種用于磷酸肽富集和分離的離心式裝置。所述離心式富集裝置包括富集槍頭、分離槍頭和餾分收集器；富集槍頭內填充有固相萃取膜片A和二氧化鈦填料，固相萃取膜片A上覆蓋有八烷基膜，固相萃取膜片A靠近富集槍頭的出液口，分離槍頭內填充有固相萃取膜片B和C18反相填料，固相萃取膜片B上覆蓋有十八烷基膜，固相萃取膜片B靠近分離槍頭的出液口；富集槍頭可設置于分離槍頭內；富集槍頭和分離槍頭均可與餾分收集器配合。本發明通過TiO₂富集槍頭和C₁₈反相填料分離槍頭將磷酸肽的富集和反相分離有機結合，有效精簡了實驗步驟，減少了樣品損失；非常適合用于大規模、微量臨床樣品的磷酸肽分析，在蛋白質組翻譯后修飾的富集研究中具有良好的應用潛力。

技術領域

本發明涉及一種用于磷酸肽富集和分離的離心式裝置，屬于分析化學領域。

背景技術

磷酸化是蛋白質最常見的翻譯后修飾之一，是指由蛋白激酶催化在底物蛋白質氨基酸殘基上添加共價結合的磷酸根基團。其逆反應為由蛋白磷酸酶催化的去磷酸化過 程。蛋白激酶和磷酸酶獨立工作，并在平衡中調節蛋白質的功能。有研究表明，在由 基因編碼的蛋白中，約30％會發生磷酸化。蛋白質的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程 幾乎調節著生命活動的所有過程，包括細胞的增殖、發育和分化，分子識別和信號傳 導，神經活動，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發生等。蛋白質磷酸化在1906年由洛克菲 勒醫學研究所的PhoebusLevene首次報道，他發現了磷酸化的卵黃蛋白。然而，直到 1954年，蛋白質的磷酸化過程才由Burnett和Kennedy報道發現。1955年Fisher和 Krebs揭示了可逆的磷酸化過程在生物調節機制中的重要性，并因此獲得了諾貝爾生 理和醫學獎。由于蛋白質磷酸化具有十分廣泛而顯著的生理意義，因此關于磷酸化的 研究成為蛋白質組學領域里重要的焦點之一。質譜是目前蛋白質組翻譯后修飾鑒定研 究最有力的工具。然而目前以生物質譜為主要研究手段的磷酸化蛋白質組學研究還面 臨著一系列技術挑戰：磷酸化蛋白質在生物體內含量極低，研究認為，一般在某一特 定的時間，磷酸化的蛋白質相對于生物體的總體蛋白質而言，含量僅為2～3％；在質 譜檢測時，大量的非磷酸化肽段會對磷酸化肽段的信號造成干擾和抑制；磷酸化肽段 具有負電性，在質譜分析常用的正離子模式下，離子化困難，信號會受到抑制。這些 問題都給磷酸化肽段的規模化鑒定帶來不小的困難。因而在對較復雜的樣本進行質譜 分析前，先對磷酸化肽段進行特異性的富集，提高其在樣本中的含量，并去除非磷酸 肽的干擾，對于提高磷酸肽的分析靈敏度和鑒定規模就顯得尤為重要。目前常用的磷酸肽富集方法主要有金屬氧化物親和色譜(MOAC)、固相金屬離子親和色譜(IMAC)、 離子交換色譜(SAX/SCX)等。金屬氧化物親和色譜的原理是利用過渡金屬氧化物與 磷酸根的可逆結合選擇性富集磷酸化肽段，常用的金屬氧化物有二氧化鈦(TiO₂)、二 氧化鋯(ZrO₂)等。二氧化鈦因其富集效果好、成本較低而得到了廣泛應用。但其依 然存在一些問題：(1)所需樣品起始量大，(2)實驗步驟繁瑣，極為費時費力，(3) 樣品分析通量有限，(4)富集鑒定結果的重現性較差。此外，由于目前使用的生物質 譜儀器在掃描速度方面的局限性，富集后的磷酸肽樣品一般需要經過反相色譜分離為 多個餾分，進一步降低樣品的復雜程度后再進行質譜分析，從而可以有效提高磷酸肽 的鑒定規模。然而目前廣泛采用的反相色譜柱式肽段分離模式，樣本損失較大，而且 需要配合液相色譜儀器使用，樣品處理通量有限。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于磷酸肽富集和分離的離心式富集裝置，具有快速、操作簡便、便于微量樣本分析和高通量的特點，可平行處理多個樣品。

本發明所提供的用于磷酸肽富集和分離的離心式富集裝置，包括富集槍頭、分離槍頭和餾分收集器；

所述富集槍頭內填充有固相萃取膜片A和二氧化鈦填料，所述固相萃取膜片A 上覆蓋有八烷基膜，所述固相萃取膜片A靠近所述富集槍頭的出液口；