[發(fā)明專利]一種FSH?HSA融合蛋白及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710506659.8
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107082815A
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發(fā)明（設計）人: 林帥;靳維維;戴明舒;李浩強
• 申請（專利權）人: 杭州皓陽生物技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

【技術領域】

本發(fā)明涉及人類生殖領域，具體涉及一種FSH-HSA融合蛋白及其制備方法。

【背景技術】

促卵泡生成素(Follicle Stimulating Hormone，簡稱FSH)，是一種由腦垂體前葉嗜喊性細胞合成與分泌的高度糖基化蛋白，與腦垂體分泌的其他糖蛋白激素如促黃體激素(LH)、促甲狀腺激素(TSH)，還有胎盤分泌的促絨毛膜激素(HCG)共同組成糖蛋白家族，都由α亞基和β亞基所組成，α亞基相同，而β亞基具有激素各自的特異性，是激素生物活性和免疫原性的決定因素。FSH的α亞基由92-96個氨基酸組成，β亞基由109-115個氨基酸組成。兩亞基通過內部二硫鍵維持自身正確的三級結構，C端殘基的位置決定其折疊的三維空間結構。根據(jù)Qing R.Fan等人在nature上發(fā)表的FSH與其受體的三維結構，F(xiàn)SH主要通過β亞基的C端與其受體結合，同時β亞基的C端通過內部二硫鍵的固定與α亞基緊密結合，其中真正與受體的結合位點是β亞基的C端第89-105位氨基酸，它像三明治一樣，夾在α亞基的L2環(huán)和C端中間。女性卵泡顆粒細胞上含有FSH的特異性受體，雌激素協(xié)同F(xiàn)SH使顆粒細胞增生，內膜細胞分化，卵泡液形成，卵泡腔擴大，從而促進卵泡生長和發(fā)育成熟。卵泡在生長過程中會釋放抑制素以阻斷卵泡剌激素的進一步合成，并呈劑量依賴關系。這一機制保證了排卵的選擇性。男性由細胞精管內的支持細胞是FSH的靶細胞，F(xiàn)SH與支持細胞上的特異性受體結合后將剌激由細精管上皮和次級精母細胞的發(fā)育，在LH和雄激素的協(xié)同下促進精子發(fā)育成熟。因為FSH對女性的卵泡成熟和男性的精子發(fā)育有非常重要意義，因而可以單獨使用FSH或聯(lián)合LH應用治療不育不孕癥。

FSH可以從腦垂體或絕經(jīng)后的婦女尿液中分離得到，但尿源hFSH存在病毒污染、原料來源有限、采集困難、含量低及純化過程復雜等問題，歐美等發(fā)達國家普遍不接受尿源產(chǎn)品上市和銷售。FSH也可以重組生產(chǎn)(US5，639，640、US5，156，957、US4，840，896、EP211，894)，但仍然存在一些缺點。首先，其半衰期短。刺激女性卵泡發(fā)生需要連續(xù)8-10天，有時高達21天，而對于低促性腺激素的男性，誘導精子發(fā)生需要高達18個月。為達到臨床效果，需每天肌肉注射或皮下注射給藥，這樣的給藥方案經(jīng)常伴有局部反應和不適，常見的并發(fā)癥如卵巢過渡刺激綜合征，變現(xiàn)為卵巢增大、全身毛細血管通透性增加和腹水形成，重者可危及患者生命。其次，目前重組hFSH表達量低，制備過程復雜和生產(chǎn)成本巨大。因而開發(fā)長效FSH，減少給藥頻率具有實際臨床應用價值。

近年來有多篇專利及文章報道開發(fā)長效FSH，主要分為兩類，一種是通過增加FSH的糖基化位點來達到提高半衰期的目的，另一種通過與Fc片段融合來提高蛋白體內半衰期。前者可再細分為兩類，一種是在FSH分子內部增加糖基化修飾位點，如W001/58493公開了可以在FSH的α亞基進行的77種突變和可以在FSH的β亞基進行的51種突變，但其未公開其突變后的效果；另一種是在序列末端添加額外序列來增加糖基化修飾位點。目前開發(fā)比較成功的是2010年由德國默克公司上市的elonva，該類似物具有天然FSH的生物活性，但卻具有較長的循環(huán)半衰期，在人體內的半衰期約69h。蛋白具體序列在專利US5，338，835和US5，585，345中公開，是一種改造的FSHβ亞基，其C末端谷氨酸以hCG的羧基末端肽(CTP)基團延長。

IgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質，它們的半衰期可高達到21天，而Fc片段是IgG保持體內較長半衰期的主要原因，F(xiàn)c片段可與新生Fc受體(FcRn)結合，避免IgG進入溶酶體中被降解。因此，IgG的Fc片段被用來與活性蛋白連接構成融合蛋白，以提高活性蛋白的體內半衰期，達到長效的目的。專利USO，186，662公布了通過構建FSH-FC融合蛋白同二聚體、異二聚體，在大鼠體內半衰期提高至60h。但該蛋白按三天給藥一次，F(xiàn)SH已經(jīng)代謝完畢沒有活性。CN201210476665在此基礎上加以完善，F(xiàn)SH融合蛋白的的β亞基直接或者間接通過鏈接元件linker融合在FC片段上，保留原有親和力的前提下，增強了體內半衰期。但是其半衰期仍只有30-40小時(文獻報道標準品重組FSH為12h)，且需達到同等效果劑量約為Gonal-F的十倍，用量大。CN201310529897介紹另一種FSH-Fc融合蛋白，該蛋白特征為β亞基鏈接CTP，α亞基鏈接Fc片段，α亞基通過共價鍵形式與CTP相連。此蛋白活性與重組FSH相當，但其半衰期也仍只有重組FSH的三倍左右。