[發(fā)明專利]采用ddPCR方法鑒定PML?RARα融合基因中的Brc3亞型

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710505991.2
• 申請(qǐng)日: 2017-06-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107523615A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐詩(shī)瑤;陸軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云健康基因科技（上海）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因鑒定方法技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種采用ddPCR方法鑒定PML-RARα融合基因中的Brc3亞型。

背景技術(shù)

PML-RARα融合基因由t(15:17)(q22:q21)易位形成，常見(jiàn)于急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)。RARα和PML的fusion具有以下特征：RARα基因斷裂位點(diǎn)位于第二內(nèi)含子；而PML基因有三個(gè)區(qū)域參與了t(15：17)易位，即內(nèi)含子6(Brc1，約占55％)、外顯子6(Brc3，約占5％)、內(nèi)含子3(brc3，約占40％)。 PML-RARα融合基因根據(jù)斷裂位點(diǎn)的位置可分為三種亞型：如圖1所示,長(zhǎng)型(L 型、Brc1)、變異型(V型、Brc3)和短型(S型、brc3)。目前白血病的治療較有效，其病人生存期得到了延長(zhǎng)，但后期跟進(jìn)發(fā)現(xiàn)數(shù)年內(nèi)復(fù)發(fā)率較高，可能原因?yàn)槟壳安捎肦T-PCR檢測(cè)技術(shù)其檢測(cè)靈敏度僅為0.1％。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種具有高靈敏度的采用 ddPCR方法鑒定PML-RARα融合基因中的Brc3亞型。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種采用ddPCR方法鑒定PML-RARα融合基因中的Brc3亞型，所述ddPCR方法包括提取血液中的RNA及QC評(píng)估，具體操作過(guò)程如下：

(1)提取RNA，將血漿分裝在1.5ml EP管中，每管分裝300μl；使用天根試劑盒中自帶的細(xì)胞裂解液CL，加入750μl至血液中，上下顛倒混勻，靜置1min；10000rpm離心1min；棄上清，留沉淀；再加入700μl CL至血液中，同等條件下離心，棄上清，留沉淀；

(2)加入150μl buffer PKD，吹打混勻；然后加入10μl蛋白酶K，吹打混勻；樣本于恒溫儀56℃、轉(zhuǎn)速350rpm、15min后迅速置于冰上3min； 13400rpm離心15min，轉(zhuǎn)移上清160μl至1.5ml EP管中；將上清置于恒溫儀上80℃孵育15min，13400rpm快速離心30s；加入320μl buffer RLT，吹打混勻，再加入1000μl 96～100％乙醇，渦旋混勻；

(3)每次轉(zhuǎn)移700μl樣本至RNeasy MinElute離心柱中，13400rpm離心15s，棄濾液，重復(fù)本步驟直到將所有樣本過(guò)柱完畢；加350μl buffer FRN 到離心柱，13400rpm離心15s，棄濾液；

(4)配mix:10μl DNaseI和70μl buffer RDD，吹打混勻，將其加到離心柱中的膜上，置于室溫20～30℃溫度下15min；加500μl buffer FRN 至離心柱，13400rpm離心15s，保留濾液；換一個(gè)新的2ml收集管，將濾液重新加入到離心柱，13400rpm離心15s，棄濾液；

(5)加入500μl buffer RPE至離心柱，13400rpm離心15s，棄濾液，重復(fù)一次；將離心柱置于新的2ml收集管中，管蓋打開(kāi)，13400rpm離心5min；將離心柱置于新的1.5ml EP管中，加入25μl RNase-free water至離心柱中央的濾膜上，閉合管蓋，室溫15～25℃溫度下靜置1min；13400rpm離心1min；提取的RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或凍存于-80℃；

(6)RNA QC評(píng)估：使用Nanodrop對(duì)RNA進(jìn)行定量并參考A260/280數(shù)據(jù)，或者使用labchip/2100進(jìn)行RNA質(zhì)量評(píng)估，評(píng)估RIN值。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明基于現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)技術(shù)的局限性，采用更加高靈敏的ddPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，旨在對(duì)臨床具有指導(dǎo)意義，其靈敏度可達(dá)0.01％。如圖2所示，本發(fā)明檢測(cè)的立意如下：本發(fā)明針對(duì)常見(jiàn)的Brc3型(約占5％)，設(shè)計(jì)檢測(cè)fusion探針(FAM)，引物針對(duì)fusion兩側(cè)序列進(jìn)行擴(kuò)增；將RARΑ基因作為內(nèi)參，設(shè)計(jì)Ref探針(HEX)，引物僅擴(kuò)增RARΑ基因。本發(fā)明采用ddPCR方法鑒定PML-RARα融合基因中的Brc3亞型的優(yōu)點(diǎn)有：1、ddPCR 檢測(cè)PML-RARΑ融合bcr3亞型可達(dá)0.01％的豐度，遠(yuǎn)超RT-PCR的0.1％，重復(fù)性好，無(wú)假陽(yáng)性；2、在低AF(0.01％)的情況下，建議樣本投入量增加，或重復(fù)多個(gè)平行操作。由于該技術(shù)的高靈敏度，因此可應(yīng)用于疾病的早期確診、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和防治復(fù)發(fā)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明PML-RARα構(gòu)型圖；

圖2是本發(fā)明Brc3構(gòu)型圖；

圖3是本發(fā)明ddPCR的結(jié)果柱形圖。

具體實(shí)施方式