[發(fā)明專利]采用ddPCR方法鑒定PML?RARα融合基因中的Brc3亞型

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710505991.2
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107523615A
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐詩瑤;陸軍
• 申請（專利權(quán)）人: 云健康基因科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種采用ddPCR方法鑒定PML-RARα融合基因中的Brc3亞型，其特征在于：所述ddPCR方法包括提取血液中的RNA及QC評估，具體操作過程如下：

（1）提取RNA，將血漿分裝在1.5ml EP管中，每管分裝300μl；使用天根試劑盒中自帶的細(xì)胞裂解液CL，加入750μl至血液中，上下顛倒混勻，靜置1min；10000rpm離心1min；棄上清，留沉淀；再加入700μl CL至血液中，同等條件下離心，棄上清，留沉淀；

（2）加入150μl buffer PKD，吹打混勻；然后加入10μl蛋白酶K，吹打混勻；樣本于恒溫儀56℃、轉(zhuǎn)速350rpm、15min后迅速置于冰上3min；13400rpm離心15min，轉(zhuǎn)移上清160μl至1.5ml EP管中；將上清置于恒溫儀上80℃ 孵育15min，13400rpm快速離心30s；加入320μl buffer RLT，吹打混勻，再加入1000μl 96～100%乙醇，渦旋混勻；

（3）每次轉(zhuǎn)移700μl樣本至RNeasy MinElute離心柱中，13400rpm離心15s，棄濾液，重復(fù)本步驟直到將所有樣本過柱完畢；加350μl buffer FRN到離心柱，13400rpm離心15s，棄濾液；

（4）配mix:10μl DNaseI和70μl buffer RDD，吹打混勻，將其加到離心柱中的膜上，置于室溫20～30℃溫度下15min；加500μl buffer FRN至離心柱，13400 rpm離心15s，保留濾液；換一個(gè)新的2ml收集管，將濾液重新加入到離心柱，13400rpm離心15s，棄濾液；

（5）加入500μl buffer RPE至離心柱，13400rpm離心15s，棄濾液，重復(fù)一次；將離心柱置于新的2ml收集管中，管蓋打開，13400rpm離心5min；將離心柱置于新的1.5ml EP管中，加入25μl RNase-free water至離心柱中央的濾膜上，閉合管蓋，室溫15～25℃溫度下靜置1min；13400rpm 離心1min；提取的RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或凍存于-80℃；

（6）RNA QC評估：使用Nanodrop對RNA進(jìn)行定量并參考A260/280數(shù)據(jù)，或者使用labchip /2100進(jìn)行RNA質(zhì)量評估，評估RIN值。