[發明專利]一種基于格氏嗜鹽堿桿菌Argonaute靶向激活基因轉錄的方法

有效

• 申請號: 201710502930.0
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107266583B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 徐建勇
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/63;C12N15/113;C12N9/22
• 代理公司: 深圳市君勝知識產權代理事務所(普通合伙) 44268
• 代理人: 劉文求

本發明公開了一種NgAGO?VP64融合蛋白和導向DNA（gDNA），以及一種基于格氏嗜鹽堿桿菌Argonaute(NgAGO)靶向激活內源基因轉錄的方法。所述NgAGO?VP64融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。所述導向DNA為SEQ ID NO.3～12所示序列片段中的任一種或幾種的混合物。利用所述NgAGO?VP64融合蛋白和導向DNA與轉染試劑共轉染細胞，可靶向激活內源基因轉錄。本發明證明了NgAGO具有結合導向DNA，并具有識別靶點基因組DNA的能力。首次發現NgAGO與VP64構建成的融合蛋白在細胞內具有激活內源基因的能力。本發明解決了近期大家對NgAGO應用的懷疑觀望問題，并為后期開發為靶向基因組編輯工具和其它工具提供了支撐。

技術領域

本發明屬于生物技術領域。更具體地，涉及一種基于格氏嗜鹽堿桿菌Argonaute(NgAGO)靶向激活基因轉錄的方法。

背景技術

基因編輯技術指能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。在基礎研究、基因治療和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力。因此，基因組編輯工具具有極大的理論和臨床應用價值。

目前，基于ZFN和CAS9基因編輯工具的針對艾滋病和腫瘤的治療新手段已經進入臨床實驗。并且，初期臨床實驗結果證明了其有效性。相對于ZFN的基于蛋白與DNA識別的基因組編輯工具，CAS9作為基于RNA與DNA堿基配對識別機制，具有易于操作、利于大批量構建等優點。但由于CAS9需要RNA具有特定二級結構并且識別DNA位點必須具有PAM結構，因此對識別位點具有一定選擇性，在一定程度上限制了其應用的范圍。

另外，基于DNA與DNA識別的、無二級結構需求的格氏嗜鹽堿桿菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAGO)基因組編輯工具，具有更加廣泛的應用前景。但是，目前對于NgAGO的基因組編輯功能，大家仍持有懷疑態度，因為國內國際上的眾多科學家都無法重復這個發現。鑒于基于NgAGO的基因組編輯工具具有更加廣泛的潛在應用前景，國內國際上眾多科學家都試圖開發這款工具，但都以失敗告終。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有NgAGO基因組編輯工具技術和應用的缺陷及不足，我們的研究發現，格氏嗜鹽堿桿菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAGO)具有結合導向DNA的能力，并具有識別靶點DNA的能力，但缺乏DNA切割能力。因此，本發明將NgAGO與VP64構建成融合蛋白，該蛋白在細胞內具有激活內源基因的能力。本發明解決了近期大家對NgAGO應用的問題，并為后期開發為靶向基因組編輯工具和其它工具提供了支撐。

本發明的目的是提供一種NgAGO-VP64融合蛋白及其在基因編輯或在制備NgAGO基因組編輯工具方面的應用。

本發明另一目的是提供一種基于格氏嗜鹽堿桿菌Argonaute(NgAGO)靶向激活基因轉錄的方法。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

一種NgAGO-VP64融合蛋白，是由VP64與NgAGO融合表達獲得。具體是將VP64融合到NgAGO的C末端(記為NgC)或N末端(記為NgN)，并進行人源化密碼子優化所得。

所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

基于所述NgAGO-VP64融合蛋白的結構進行的類似蛋白序列改變且具有相同功能的蛋白，也應在本發明范圍之內。

一種表達NgAGO-VP64融合蛋白的質粒，是將NgAGO-VP64融合蛋白基因克隆到表達載體獲得。

所述表達載體包括，但不局限于瞬時表達載體、病毒載體，真核表達載體和原核表達載體，具體如表達載體pCDNA3.1。